解離が遅すぎてビアコアのレンジを外れる，あるいは，KDがぶれる場合の対処法を教えてください
解離が遅いサンプルは第一に0濃度のデータの安定性、再現性が重要になります。ほとんど解離しないデータに対してブレの大きな0濃度データを差し引きしてしまうとkdもずれやすくなるためです。したがって装置のメンテナンスや徹底した非特異的結合の除去が非常に重要になります。
その上でもう少し解離を見えやすくするテクニックとして、ランニング緩衝液の組成を変えたり測定温度を（高く）変えたりして、より解離の変化量が大きく見えるような方法があります。
また、基本的にマストランスポートリミテーションを抑えるために固定化量を下げるのがBiacore™のKinetics測定の基本ではありますが、下げすぎてしまうとこのような相互作用では解離量（RU）に対する相対的な誤差が大きくなってしまいます。ですのでマストランスポートリミテーションの影響が少ないことを確認しながらある程度なら固定化量をあげるのも良いです。同様の理由で、低濃度帯の添加でレスポンスが小さいときは解離量の相対的誤差が大きくなりますので、シングルサイクルカイネティクスを用いて、最高濃度の解離領域を中心にフィッティングするようにすることが勧められます
Fragmentのclean screeningにおいて、固定化タンパクが十分に活性を保っていることは必ずしも必要なのか、考え方を教えていただけないでしょうか？
Fragment Clean Screenに関してはフラグメントの特異性を確認しているわけではなく、物性の悪いフラグメントを除外することが目的になります。その意味で固定化タンパク質が十分に活性を保っている必要は必ずしもありませんが、Binding level screening の時により活性の高いタンパク質をご使用できる環境でしたら、同様の品質のものを使うのが良いと思います。固定化タンパク質そのものが変性した状態でチップ上に固定化されていることで、本来特異的に結合するはずのフラグメントが、その変性したタンパク質の露出した疎水表面に非特異的結合するなどで、除外しなくてよいものを除外してしまうリスクは発生しますので注意が必要です。
Actual RUがtheoretical RUより大きい場合（例えば300%）の考えられる原因を教えてください．
原因としては、下記が想定されます。
- アナライトがチップ表面や標的タンパク質自体と非特異的に結合している
- アナライトが凝集している
- アナライトが標的タンパク質と1:1 bindingしていない（特異的ではあるが結合様式が単純でない）
非常に稀なケースですが高屈折率の化合物において問題のない1:1結合であったとしてもActual Rmaxが高くなることがあります。（ですが300%までになることはないと考えて良いレベルです）
低分子の測定において、センサーグラムが大きく跳ねるなど荒れたものになり、kineticsやaffinity解析が出来ないデータが多く得られる場合にどのような問題が考えらえるでしょうか。戦略以前の問題になるのですが、
ケースバイケースになると思いますので、もしよろしければ弊社バイオダイレクトラインまでお問合せください。以下は一般論として申し上げます。
センサーグラムが解析できないほど大きく跳ねるということですので、スパイクノイズとして出がちなエアーの混入というよりは大粒子がチップ上を通過したように思えます。大粒子はアナライトの凝集物だったり、前のサイクルで添加し流路に残存してしまったアナライトが測定中に剥がれ落ちたなどの影響がありそうです。解決策としては、使用前のシステムのDesorb&Sanitizeの実施の他、もしランニング緩衝液に界面活性剤が含まれていないのであれば追加、アナライトが溶解しやすいDMSO濃度でのランニング緩衝液の調製、アナライトの添加濃度を下げ溶解性を高める、アナライトの添加後は毎回Extra washを実施するなどになります。
