バイオダイレクトメール vol.4 Technical Tips
＜DNAシークエンシング用鋳型調製試薬＞
今回はDNAシークエンス用鋳型調製試薬、TempliPhi™ DNA Amplification Kitで利用している2つの技術についての紹介です。
Phi29 DNA Polymerase
Phi29 DNA Polymeraseはそれ自身でヘリカーゼ様活性及びプルーフリーディング(校正)活性を持つというユニークな酵素です。ヘリカーゼ様活性により2本鎖DNAをほどきながら複製行うことができます。DNAが環状の際には1周した後も引き続き合成するため元の大きさより長いサンプルを得ることができます。このPhi29を用いた増幅方法はRCA法と呼ばれています。
この活性は非常に安定しており30℃、12時間の反応で1つの複製起点から70,000塩基長以上が合成されます。また、校正活性を持つため読み違いを修正することができます。エラー率は10-7乗で、この値はTaq Polymeraseの約1,000分の1となっており非常に正確な合成が行われることが分かります。
Multi Primed Amplification
ランダムヘキサマープライマーを利用したDNA複製方法です。プライマーは環状DNAの任意の場所に結合し多くの複製起点ができます。
以上2つの技術を組み合わせて環状DNAに適用すると数時間のうちに109コピーまでの増幅が可能になります。これはシングルプライマーを利用したPhi29の合成効率の約200倍にあたります。この高い効率性を利用して作られたのがTempliPhi™です。
（━ランダムヘキサマー； 
Phi29 DNA polymerase）
ランダムヘキサマーが環状DNAに結合し（A）、Phi29 DNA polymeraseによって伸長反応が行われます（B）。Phi29 DNA polymeraseの鎖置換活性により合成された鎖を置換しながら合成を進めます（C）。ランダムヘキサマーがアニールする部位が新たに露出し、branching（ブランチング）と呼ばれる現象により合成が進行します（D）。
