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ÄKTA™ avant 25写真

モノクローナル抗体精製の迅速なプロセス開発
(ÄKTA™ avant 25使用例)

ÄKTA™ avant 25システムはコントロールソフトウェアにUNICORN™ 6を採用しており、モノクローナル抗体(MAb)精製用の2ステップクロマトグラフィープロセスの開発に使うことができます。この使用例では、1段階目のキャプチャーステップにはProtein Aクロマトグラフィー担体(レジン)であるMabSelect SuRe™を、2段階目のポリッシングステップには、不純物の除去にCapto™ adhereを使用しました。ポリッシングステップの添加条件スクリーニングには実験計画法を用い、サンプルのpH、電気伝導度、添加量を変動させて検討を行いました。1 mlのプレパックHiTrap™カラムを用いたプロセス条件の堅牢性の確認は、24時間以内に完了しました。UNICORN™ 6に組み込まれた実験計画法(DoE)機能とプレパックのHiScreen™カラムを使用し、プロセス全体の至適化は約1週間で完了しました。対象としたフィード液の特性は難易度の高いものでしたが、目的とするモノクローナル抗体を高収率・高純度で精製することができました。

はじめに

バイオ医薬品原料の精製プロセスの開発では、時間と柔軟性は欠くことのできないポイントです。ÄKTA™ avant 25は、剛性の高いクロマトグラフィー担体にも対応した、自動でプロセス開発ができるシステムです。UNICORN™ 6ソフトウェアに組み込まれた実験計画法(DoE)機能により、生産性はさらに高まります。DoE(図1)を用いると容易かつ迅速にプロセス開発を行うことができます。DoEはクロマトグラフィー条件の至適化の強力なツールであり、プロセス開発ラボのスループット改善につながります。


図1. UNICORN™ 6ソフトウェアにはDoE機能が組み込まれており、プロセス開発が容易かつ迅速に行えます。DoEでは複数の条件を同時に変動させることができ、データから統計モデルを構築できます。モデルは妥当性の確認後、意志決定の役に立つシステムのマップ作成に使われます。

モノクローナル抗体(MAb)精製では、選択性が高く、高い純度が得られることと、スケールの大小を問わず使用が容易であることから、Protein A担体がクロマトグラフィーのキャプチャー工程の第一選択となります。そのことから、Protein A担体がMAb精製プラットフォームの基本となります。

キャプチャーに続くダウンストリームプロセスでは、さまざまなクロマトグラフィー手法やそれら技術の組合せ、特にイオン交換クロマトグラフィーと疎水性相互作用クロマトグラフィーを行います。MAb精製の新しいアプローチの1つに、陰イオン交換およびその他の相互作用を兼ね備えたマルチモーダルクロマトグラフィー担体を用いた2段階プロセスがあります(図2)。このプロセスでは、抗体の二量体や凝集体(D/A)、宿主細胞由来のタンパク質(HCP)、DNA、ウイルスを同時に除去できます(参考文献1、2)。精製プロセス全体を至適化することで、マルチモーダルクロマトグラフィー担体の特長を完全に引き出すことができます。


図2.従来の3段階精製では、MabSelect SuRe™、SP Sepharose™ Fast Flow、Capto™ adhereを使用します(左の矢印)。一方、二段階精製では、MabSelect SuRe™とCapto™ adhereを使用します(中央)。また、Capto™担体を用いたポリッシングによる3段階精製という選択肢もあります(右の矢印)。

ÄKTA™ avant 25のUNICORN™ 6コントロールを用いて、MAb精製のメソッドを以下表1の通り編集しました。(1)アフィニティークロマトグラフィーの1番目の実験として、MAb溶出に適したpHの範囲を決定するためのpH溶出実験、(2)動的結合容量を調べるための分析、(3)フィード液からのMAb精製、(4)アフィニティー工程の精製メソッドをスケールアップ、(5)プールした粗精製抗体を用い、ポリッシング工程の添加条件の検討、(6)DoEを用いたパラメーターのスクリーニング、(7)DoEを用いた堅牢性の実験。

材料と方法

カラム、装置およびMAbの精製

今回のMAb精製では、サンプルインレットバルブを2つ備え、サンプルの添加と洗浄を自動化できるÄKTA™ avant 25を使用し、システムのコントロールはUNICORN™ 6ソフトウェアで行いました。

ÄKTA™ avant 25の圧力・流速制御機能により、サンプル添加中に過剰な圧力がかかることなく、操作ができました。MabSelect SuRe™を用いたアフィニティークロマトグラフィーとCapto™ adhereを用いたイオン交換クロマトグラフィーには、どちらも基本的に同じメソッドを用いました。実験のさまざまなステップにおいて、MabSelect SuRe™およびCapto™ adhereがあらかじめ充填されたHiTrap™(1 ml)およびHiScreen™(4.7 ml)プレパックカラムを利用しました(表1)。ポリッシング工程の至適化に用いるサンプルの精製には、MabSelect SuRe™を充填したXK 50/20カラムを使用しました(表1、ステップ4)。

表1.カラムおよび条件の要約
ステップ 説明・目的 カラム バッファー
1 MabSelect SuRe™工程の溶出pHの決定 HiScreen™ MabSelect SuRe™ 20 mMクエン酸、pH 6.0~3.0
2 MabSelect SuRe™の動的結合容量の決定 HiTrap™ MabSelect SuRe™ PBS(pH 7.4)およびクエン酸(pH 3.5)
3 MabSelect SuRe™を用いたMAb精製 HiScreen™ MabSelect SuRe™ PBS(pH 7.4)およびクエン酸(pH 3.5)
4 Capto™ adhereによるポリッシング工程用サンプルの準備(スケールアップ) MabSelect SuRe™を充填したXK 50/20カラム(ベッド高=8.4 cm、Vc=165 ml) PBS(pH 7.4)およびクエン酸(pH 3.5)
5 Capto™ adhereでの添加条件の決定 HiScreen™ Capto™ adhere 20 mMリン酸ナトリウム、20 mMクエン酸、pH 7.8~4.0
6 実験計画法(DoE)を用いたCapto™ adhereでの添加条件のスクリーニング HiTrap™ Capto™ adhere 20 mMリン酸ナトリウム、20 mMクエン酸、pH 7.5、6.75および6.0
7 Capto™ adhereでの堅牢性の検討 HiTrap™ Capto™ adhere 50 mMリン酸ナトリウム、pH 6.95、6.75および6.55

実験計画法を用いたCapto™ adhere工程の添加条件のスクリーニング

電気伝導度、pH、サンプル添加量は、Capto™ adhereへのサンプル添加において重要なパラメーターです(参考文献1)。したがって、多くの異なる条件(要因)を同時に調べられるように実験系を準備することが望まれます。統計によってプロセスや目的物にもっとも大きく影響する要因を特定し明確にできるので、実験計画法(DoE)の利用が適しています。DoEでは、厳選した一連の実験を通じて、関連する全ての要因を同時に変動させて評価し、最大限の情報を得ることができます。メソッドの至適化では、DoEを利用することで最適な精製条件を定められる確率が高まります。

本研究では、Capto™ adhereのサンプル添加条件のスクリーニングに、UNICORN™ 6に組み込まれた全実施実験要因計画法(FFD: Full Factorial Design法)を用いました(表1、ステップ6)。3つのパラメーター、サンプル添加量、電気伝導度、pHを含む全実施実験要因計画法では、23=8実験と3つの中央値から、合計11実験となります(表2)。中央値は、サンプル添加量が192 mg/ml担体、電気伝導度20 mS/cm、pH 6.75となります。開始時の濃度は10.8から11.7 mg MAb/mlの間で変動し、HCPは平均45 ppm、Protein Aは2 ppm、D/Aが1.9%でした。

MAbの溶出濃度はpHに依存し約pH 5.79で最大となり、通常はこのような実験系ではさらに低い値で最大となります。しかし、今回は、低pHおよび低電気伝導度(< 10 mS/cm)でサンプルの沈殿が認められたため、電気伝導度を10 mS/cm以上に維持し、pHの下限は6.0としました。pHの上限については、通常溶出pHよりも2高い値が選択されますが、今回の例ではpH 7.5としました。電気伝導度は10~30 mS/cm、添加量は100~300 mg MAb/ml担体としました。

表2.添加条件スクリーニングのためのDoEデザインレイアウトとスクリーニング結果
DoE no. Run order no. 添加量(mg/ml担体) 添加条件(mS/cm) 添加pH 回収率(%) HCP (ppm) Protein A (ppm) D/A (%)
DoE 1 8 100 10 6.0 82.3 9 < 1 0.93
DoE 2 1 301 10 6.0 98.0 31 < 1 0.67
DoE 3 10 104 30 6.0 72.6 10 < 1 0.65
DoE 4 7 312 30 6.0 96.4 16 < 1 0.86
DoE 5 6 93 10 7.5 49.0*1 8 < 1 0.22
DoE 6 3 282 10 7.5 92.9 26 < 1 0.65
DoE 7 11 102 30 7.5 70.3 10 < 1 0.49
DoE 8 9 307 30 7.5 93.2 22 < 1 1.04
DoE 9*2 5 192 20 6.75 92.2 13 < 1 0.86
DoE 10*2 4 192 20 6.75 95.1 13 < 1 0.81
DoE 11*2 2 192 20 6.75 93.4 12 < 1 0.69

*1: DoE 5では異常値を除外
*2: DoE 9~11は中央値(添加量192 mg/ml、伝導度20 mS/cm、pH 6.75)

Capto™ adhere工程の堅牢性の検討

スクリーニングDoEから求めた条件の周辺で、pH、電気伝導度、添加量を変動させ堅牢性を調べました。また、2つの異なるフィード液と担体については2つの異なるロットで検討しました。

どちらのフィード液もスクリーニングDoEで用いたフィード液より高濃度の不純物を含んでいました。5つのパラメーターで構築した減数実験、8実験と3つの中央値の合計11実験を設定しました(表3)。2つのフィード液の開始サンプル濃度は、12.7~14.7 mg MAb/mlで変動し、HCPはどちらも80 ppmでした。Protein Aはフィード1では3 ppm、フィード2では4 ppmでした。D/A は、フィード1では平均5.3%、フィード2では3%でした。DoE 9~11は中央値(添加量200 mg/ml、電気伝導度15 mS/cm、pH 6.75)です。

表3.添加条件の堅牢性実験のためのDoEデザインレイアウトとその結果
DoE no. Run order no. 添加量
(mg/ml担体)
添加条件
(mS/cm)
添加pH クロマトグラフィー
担体のロット
サンプルの
フィード
回収率(%) HCP (ppm) Protein A (ppm) D/A (%)
DoE 1 2 190 17 6.55 A Feed 2 86.7 20 < 1 2.3
DoE 2 9 210 13 6.55 A Feed 1 93.9 55 2 1.2
DoE 3 3 190 17 6.95 A Feed 1 76.1 25 < 1 1.7
DoE 4 10 210 13 6.95 A Feed 2 83.7 55 2 1.5
DoE 5 4 190 13 6.55 B Feed 2 86.4 25 < 1 2.1
DoE 6 5 210 17 6.55 B Feed 1 85.3 55 2 1.3
DoE 7 7 190 13 6.95 B Feed 1 78.1 15 < 1 1.9
DoE 8 6 210 17 6.95 B Feed 2 88.3 25 < 1 2.2
DoE 9*1 1 200 15 6.75 A Feed 1 81.9 20 < 1 2.5
DoE 10*1 8 200 15 6.75 A Feed 1 85.4 55 1 1.7
DoE 11*1 11 200 15 6.75 A Feed 1 83.2 25 < 1 2.4

*1: DoE 9~11は中央値(添加量200 mg/ml、伝導度15 mS/cm、pH 6.75)

収量、HCPクリアランス、凝集体量、Protein A漏出の測定

回収率と濃度の測定

濃度測定は波長280 nmのUV測定(吸光係数は1.49)か、ÄKTA™explorer 10とHiTrap™ MabSelect SuRe™ 1 mlカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーで行いました。

二量体・凝集体の分析

素通り画分は、相互に接続した2本のSuperdex™ 200 5/150 GLカラムとÄKTA™explorer 10を用いたゲルろ過(サイズ排斥クロマトグラフィー)で分析しました。分取したサンプルをカラムに添加し、PBSを用いて流速0.35 ml/minで15分間流しました。凝集体濃度は、波長280 nmのUV測定を行い、ピークエリア比を計算することで算出しました。

宿主細胞由来タンパク質(HCP)とリガンド漏出の分析

HCP濃度は市販の抗CHO HCP抗体(Cygnus Technologies Inc.)を用いて測定しました。基本的にはELISA法で、Gyros AB(Uppsala, Sweden)のGyrolab Bioaffy 20 HCマイクロラボラトリーディスクを用いて、Gyrolab Workstation LIFで行いました。リガンドの漏出(MabSelect SuRe™ Protein Aリガンド)測定には、市販のELISAキット(Repligen Corp., Waltham, MA, USA)を使用し、プロトコールには若干の改変を加えました。

SDS-PAGE分析

サンプルは1M NaOHを用いてpH 8.5に合わせました。ジメチルホルムアミドを用いてCyDye™ DIGE Fluor minimal dye(Cy5)の溶液を調製しました(12.5 μlのジメチルホルムアミド中に5 nmolのCyDye™)。50 μgのタンパク質に1 μlのCy5溶液を添加し、遮光して氷上で30分間インキュベーションしました。1 μlの10 mMリジンを添加して反応を停止しました。非還元サンプル(5 μg/well)を ExcelGel™ SDS Gradient 8-18プレキャストゲルとMultiphor II水平型電気泳動システムを用いて泳動しました。ゲルのスキャンにはEttan™ DIGE Imagerを使用しました。MAbおよび不純物の量がかなり異なることを考慮し、PMT(光電子増倍管)の電圧は複数の異なる設定を用いました。

結果と考察

2段階精製はProtein A担体によるキャプチャー工程とマルチモーダル陰イオン交換によるポリッシング工程からなるプロセスです。ÄKTA™ avant 25と制御ソフトウェアUNICORN™ 6を使うと、プロセスの開発は約1週間で完了しました。開発したメソッドでは、高純度のMAbを高い効率で回収できました。今回達成された純度はほとんどの治療用医薬品において十分なものと思われますが、さらに純度を高めるには、3段階精製を行うこともできます。

今回の材料は、主にサンプルの沈殿の問題から、2段階目の実験条件において、高い電気伝導度の設定をを余儀なくされる、難易度の高いものでした。

通常、電気伝導度が低い方が不純物の除去には有利です(参考文献1)。時間が経過した場合とpHが低い場合に、MAbが凝集してしまう点も、今回の材料の難点でした。その結果、最初の実験に使ったサンプルのD/Aは、後の実験、例えば堅牢性の検討に使ったサンプルよりも低くなりました。

MabSelect SuRe™を用いたMAbのキャプチャー

MabSelect SuRe™での溶出pHと動的結合容量の決定

MAbの溶出はpHのリニアグラジエントで行いました(図3)。ピーク最大値の溶出pHは3.67で、pH 3.56ではピーク最大値の10%になりました(減少傾向)。この結果から、収量を高め溶出ピークを狭くするために、溶出pHは3.5としました。10% breakthroughにおける動的結合容量(DBC 10%)は、滞留時間2.4分と4分で、それぞれ21、40 mg/mlとなりました。


図3.HiScreen™ MabSelect SuRe™を用いた溶出pHの決定

カラム HiScreen™ MabSelect SuRe™, 4.7 ml
サンプル 1.72 mg MAb/mlのMAbを含む清澄化CHOフィード液、1 ml
結合バッファー 20 mMクエン酸、pH 6.0
溶出バッファー 20 mMクエン酸、pH 3.0
グラジエント リニア、20 mMクエン酸バッファー、pH 6.0~3.0、10カラム体積
流速 0.5 ml/min
精製装置 ÄKTA™ avant 25

MabSelect SuRe™を用いたMAbの精製

図4は、HiScreen™ MabSelect SuRe™カラムでMAbを精製した際のクロマトグラムの例です。回収率は99%に達し、HCPは25 ppm、D/Aは0.8%、Protein Aは6 ppmでした。


図4.HiScreen™ MabSelect SuRe™を用いたMAbの精製。素通り画分の後の最初のピークは精製されたMAb、2番目のピークはCIPの不純物を含む。pH(赤)の顕著な低下は、NaOHの添加中にpHの測定を省略した結果。この付近のpH変化は実データと異なる。

カラム HiScreen™ MabSelect SuRe™, 4.7 ml
サンプル 1.17 mg MAb/mlのMAbを含む清澄化CHOフィード液、112.5 ml
結合バッファー PBS, pH 7.4
溶出バッファー 50 mMクエン酸、pH 3.5
流速 1.2 ml/min、滞留時間4分
グラジエント 1段階、結合バッファーから溶出バッファーへ
定置洗浄(CIP) 0.1 M NaOH、2カラム体積、接触時間15分
精製装置 ÄKTA™ avant 25

Capto™ adhereによるポリッシング工程前のXK 50/20を用いたスケールアップ

ポリッシング工程の実験に用いる材料を調製するために、メソッドをXK 50/20カラムでスケールアップしました(データなし)。スケールアップはÄKTA™explorer 100を用いて行いました。XK 50/20で精製した抗体をプールし、Capto™ adhereを用いたスクリーニングと堅牢性の検討に使用しました。XK 50/20での精製では、スケールアップ前に比べて、HCP、Protein A、D/Aともに若干高い値になりました。

Capto™ adhereによるポリッシング工程

結合および溶出条件の初期スクリーニング

pH 7.8で3 mgのMAbをHiScreen™ Capto™ adhereカラムに添加し、pH 7.8から4.0のリニアグラジエントで溶出しました。MAbは比較的幅広いピークで溶出されました(図5)。ピーク最大値の溶出pHは5.79でした。さらに至適化した場合、溶出位置はより低pH側になりますが、pHと伝導度が低い場合には沈殿を生じるというサンプルの性質から、pHの下限は6.0に設定し、電気伝導度は≥10 mS/cmに保ちました。


図5.HiScreen™ Capto™ adhereの結合および溶出条件の決定

カラム HiScreen™ Capto™ adhere, 4.7 ml
サンプル HiScreen™ MabSelect SuRe™の溶出プール1 mlを開始バッファーで3 mg/mlに希釈
開始バッファー 20 mMリン酸ナトリウム、20 mMクエン酸、pH 7.8
溶出バッファー 20 mMリン酸ナトリウム、20 mMクエン酸、pH 4.0
グラジエント リニア、20 mMリン酸、20 mMクエン酸、pH 7.8~4.0、10カラム体積
流速 2.4 ml/min
精製装置 ÄKTA™ avant 25

添加条件スクリーニングの実験計画法

図6はHiTrap™ Capto™ adhereを用いたスクリーニングデザインの典型的な素通り画分のクロマトグラムです。MAbは素通り画分に溶出しています。このデザインによるデータの要約は表2に示しています。このクロマトグラムはDoEスクリーニングの中央値のデータです(表2)。


図6.HiTrap™ Capto™ adhereを用いたスクリーニングデザインのクロマトグラム。MAbは素通り画分に溶出し、32 ml、35 ml付近の2つのピークは凝集体とCIPに由来する不純物。

カラム HiTrap™ Capto™ adhere, 1 ml
サンプル HiScreen™ MabSelect SuRe™の溶出プール(デザインの中央値、pH 6.75、伝導度15 mS/cm、添加量200 mg/ml担体)
開始バッファー 20 mMリン酸ナトリウム、20 mMクエン酸、pH 6.75。NaClを用いて伝導度を15 mS/cmに調整
再生バッファー 0.1 M酢酸、pH 3.0
グラジエント 開始バッファー、再生バッファー、CIPのステップグラジエント
流速 2.0 ml/min
CIP 1 M NaOH、接触時間15分
精製装置 ÄKTA™ avant 25

スクリーニングDoEの結果を図7に示します。結果は「Summary of fit(当てはまりの概要)」「Coefficient plot(係数プロット)」「Contour plot(等高線図)」の3つの方法で図示しました。回収率、HCPの除去、凝集体(D/A)の除去の3つの応答を分析しました。4つ目の応答、Protein Aの漏出については、統計モデルを用いたデザインを行うには低すぎました。実際、HiScreen™ MabSelect SuRe™の溶出画分のProtein A漏出は、非常に低い値でした。

Summary of fitプロットでは、モデルから導かれる応答の百分率変化(R2)が回収率、凝集体モデルともに>0.8であり、モデルによく当てはまっていることを示しています。交差検定によると、モデルから予測される応答の百分率変化(Q2)は>0.5であり、これらの要因については、モデルに高い予測能力(Predivtive power)があることが確認できました。モデルの妥当性(Model validity)の値が0.5以上であると、有力なモデルであり、最良のモデルでは0.9を超えます。HCPの除去については、モデルの質はそれほどではなく、妥当性も不十分でした。このモデルに関して、繰り返し変動を測定して得られた再現性(Reproducibility)の値は0.5以上で、エラーが少なく、実験手順のコントロールが良好であることを示しています。

Coefficient plotは信頼区間で回帰係数を示した図です。有意な係数および相互作用項に有意性であっても、単独では有意でない係数がモデルの中に残りました。

Contour plotは特定の応答に対する2つの要因の影響を示しています。

予想通り、添加量の増加は回収率に正の影響を与える一方、不純物のクリアランスは添加量を下げることで改善されました。


図7.Capto™ adhereステップの条件スクリーニングについてのDoEの結果。回収率、HCP、D/Aの3つの反応をそれぞれ分析。結果は「Summary of fit(当てはまりの概要)」「Coefficient plot(係数プロット)」「Contour plot(等高線図)」の3つの方法で図示。ここをクリックすると拡大します。

Capto™ adhereでの堅牢性実験

結果を表3に示します。図8は個々のDoEと2種類のフィード液のSDS-PAGEの結果で、図9は堅牢性検討のSummary of fitです。得られた結果はどのモデルにも当てはまらなかったため、この条件は堅牢であると見なされました。この結果は、DoE実験のSDS-PAGEの結果(合計11レーン)に明白な差が見られなかったことも、この判断を裏付けています(図8)。


図8.堅牢性DoEのSDS-PAGE。ExcelGel™ SDS Gradient 8-18を用いて非還元状態で泳動。ゲルはCy5で染色。レーン1-11はそれぞれのDoEの実験番号に対応。レーン12、13はフィード1および2。


図9.DoE堅牢性実験のフィットの概要。D/A、HCP、Protein A含量、回収率の結果。

まとめ

ÄKTA™ avant 25、UNICORN™ 6とプレパックのHiTrap™およびHiScreen™カラムを用い、およそ1週間で2段階のクロマトグラフィープロセスを開発できました。ÄKTA™ avant 25、UNICORN™ 6、MabSelect SuRe™およびCapto™ adhereプレパックカラムで、直接的にメソッドの至適化をすることができました。ÄKTA™ avant 25は標準の流路を変更することができる大変柔軟な装置です。本研究では、2つのサンプルインレットバルブを活用して、自動サンプル添加およびサンプル損失のない洗浄を行いました。最新の圧力・流速制御機能を利用することで、サンプル添加中の圧力上昇を最小限に抑えることができました。Capto™ adhereのポリッシング工程の条件検討において、DoEはたいへん有効でした。UNICORN™ 6のDoEモジュールは最適かつ堅牢な条件を見つけるためのスキームの組立てを容易にし、生産性の向上に貢献します。

参考文献

  1. Application note: Optimization of loading conditions on Capto™ adhere using Design of Experiments, 28-9078-89 Edition AA, Cytiva.
  2. Eriksson, K. et al. MAb contaminant removal with a multimodal anion exchanger. A platform step to follow protein A. BioProcess™ International, 7 (2) 52.56 (2009).

Cytivaのプロセス開発ワークフロー

CytivaのBioProcess™システム、クロマトグラフィー担体、カラム、96ウェルプレートは、キャプチャーからポリッシングまですべての精製ステップをカバーしており、また、開発やパイロット実験から製造まですべてのスケールをカバーしています。ÄKTA™ avant 25の流速および圧力はMabSelect™やCapto™などのBioProcess™担体の使用に適しています。これらのBioProcess™担体は、高流速でも大きな動的結合容量をもっています。ÄKTA™ avant 25、UNICORN™コントロールソフトウェア、そして高流速のBioProcess™担体を組み合わせることで、プロセスの時間短縮、生産性向上、容易なスケールアップを実現できます。

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