お客さまレビュー／データ紹介　illustra™ GenomiPhi™ DNA Amplification Kit その2

【データ紹介】　2-4　（全7件）

• 中井技術士事務所 日本マツタケ研究所
  中井 孝雄 先生
• 放射線影響研究所　放射線生物学/分子疫学部
  林　奉権 先生
• 防衛医科大学校 法医学講座
  松崎 雄三 先生
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※これらのデータは旧型製品で得られたデータ紹介例であり、現在は改良型のキットが販売されています。プロトコール等が異なりますので、紹介例は参考結果としてご参照ください。詳細につきましては、バイオダイレクトライン（03-5331-9336）までご連絡ください。

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中井技術士事務所 日本マツタケ研究所
中井 孝雄 先生

GenomiPhi™ DNA Amplification Kit の良いところ

• 非特異的にDNAを増幅できる
• 不純物よる反応の阻害が少ない
• 使用が極めて簡便
  （今まで下記プロトコールで抽出・精製してPCRを行っても、阻害物のため増幅できなかったサンプルがGenomiPhi™ DNA Amplification Kit であらかじめ増幅後、PCRを行うと増幅することができた）

目的

ITS領域のPCR

サンプル

マツタケシロ付近の土壌中の微生物DNAの増幅

実験の流れ

GenomiPhi™ DNA Amplification Kit で増幅した産物をABI PRISM SNaPshot Multiplex Kit（SNPs解析用）およびAmpFlSTR Profiler PCR Amplification Kit (STR解析用)により遺伝子型を検出しました。

実験方法

マツタケシロ外部約10 cmの土壌を約3 ml試験管に入れ、Nucleon PhytoPure の Reagat1を約5 µl 加えRNage の存在下65℃で30分インキュベート、以下Nucleon PhytoPure のプロトコールに使いDNAを抽出し更にQIAGEN™のQIAQuickで精製し、約0.6O.DのDNAを400 µl 得た。GenomiPhi™ DNA Amplification Kit のプロトコールに従い、上記サンプルDNA 1 ｎg、10 ngとコントロールDNAをDNA試料として反応を行った。増幅産物のO.Dは、0.583、0.548、0.539（各400 µl）であった。

【使用機器・試薬】

• 恒温水槽

GenomiPhi™ によるDNA増幅後のステップ

• 1.　PCR

  【PCR組成】

  10 × PCR　Buffer	2 µl
  25mM MgCl2	2 µl
  2mM　dNTP Mix	2 µl
  Primer ITS4	0.8 µl
  Primer ITS5	0.8 µl
  High Fidelity Taq	0.2 µl
  H2O	2.2 µl
  計	10 µl

  【使用機器・試薬】

  • GeneAmp™ PCR system 9600 （Applied Biosystems™ ）
  • GeneAmp™ High Fidelity PCR System （Applied Biosystems™ ）
• 2.　阻害実験

  サンプル	1 米沢 (4 O.D)	2 GP (1 µl)	3 GP (10 µl)	4 GP ( 1 µl)	5 GP ( 1 µl)	6 粗DNA (0.6 O.D)
  テストDNA　µl	0	7.4	7	7.4	7	6.67
  米沢　µl	1	1	1	0	0	0
  H2O　µl	9	1.6	2	2.6	3	3.33

結果 （画像をクリックすると拡大表示されます）

GenomiPhi™ DNA Amplification Kit のプロトコール通り、粗DNA1 µl 使用後の増幅DNAは、コントロールマツタケ（米沢）DNAのPCR増幅を阻害しなかったが、粗DNA10 µl使用した増幅産物はコントロールのPCR増幅を阻害した。GenomiPhi™ DNA Amplification Kit で未増幅の粗DNAは勿論全くPCR増幅はなかった。土壌中の微生物DNAの増幅に可能性が大である。

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放射線影響研究所 放射線生物学/分子疫学部
林　奉権（はやし　とものり）先生

GenomiPhi™ DNA Amplification Kit の良いところ

• 簡単に増幅ができる
• 極微量のDNAで増幅が可能である
• 多検体のサンプルを同時にこなす場合に特に有効

目的

リアルタイムPCRを用いた増幅DNAの定量、シークエンシングおよび多型解析

サンプル

ヒトの極微量しかない保存DNA

GenomiPhi™ DNA Amplification Kit を用いた実験方法

1. ゲノムDNA 1 ml (1 ng)をSample Buffer 9 mlに加えてサンプル溶液を調製。
2. サンプル溶液を95℃で3分間インキュベートする。
3. Reaction Buffer 9 mlとEnzyme Mix 1 mlを混ぜて調製した酵素反応溶液を上記サンプルに加える
4. 30℃で18時間インキュベートする。
5. 65℃で10分間インキュベートし、酵素を失活させる。

【使用機器・試薬】

• PCR装置 (GeneAmp™ 9600)

GenomiPhi™ DNA Amplification Kit によるDNA増幅後のステップ

• 1.　リアルタイムPCR による増幅

  増幅DNA 1 mlにRNase P 定量用のprimer&probe Mix 0.5 ml、TaqMan™ Universal Master Mix 5 mlを加えABI PRISM 9700HTを用いてリアルタイムPCRによるRNase Pの定量を行なった（下の結果(1)）。

  【使用機器・試薬】

  • 機器：ABI PRISM 7900HT （Applied Biosystems™ ）
  • 試薬：TaqMan™ RNase P Control Reagent とTaqMan™ Universal PCR Master Mix
• 2.　シークエンシング

  ヒトHLA-AとHLA-B遺伝子(約2 Kb)のPCR増幅とシークエンシング

  【使用機器・試薬】

  • 試薬：DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit
• 3.　SNPs 解析

  【使用機器・試薬】

  • 機器：ABI PRISM 7900HT
  • 試薬：Assays-by-Design 又はAssays-on Demand Products とTaqMan™ Universal PCR Master Mix

結果

Sample	Initial DNA (ng)	Final DNA (ng)	平均増幅DNA (ng) (Mean ± SD)
A	0.1	412	912.3 ± 830.5
B	0.1	1871
C	0.1	454
A	1	1954	1972 ± 58.1
B	1	2037
C	1	1925
A	10	4796	3783.3 ± 1446.2
B	10	4427
C	10	2127

結果に対するコメント

Whole genome amplificationのための本キットは他のDOP-PCR, I-PEP などの方法に比べて非常に効率よく増幅可能であることがわかった。RNase Pの測定からDNAは約400から9,000倍に増幅されていると考えられる。

また、2 kbのDNA増幅が可能であることがわかった。

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防衛医科大学校 法医学講座
松崎 雄三 先生

GenomiPhi™ DNA Amplification Kit の良いところ

• 変性した試料にも有効であった
• nested PCRを行えない試料の初期増幅に有効であった
• 反応系が単純で簡単だった

目的

個体識別を目的としたSTRマーカー検出のためのmultiplex PCR

サンプル

変性組織から抽出したDNA

GenomiPhi™ DNA Amplification Kit を用いた実験方法

1. 組織から抽出したDNA溶液1 µl （1 ng）
2. Sample Buffer 9 µl 加え95 ℃で3分間熱変性した
3. Reaction Buffer 9 µl とEnzyme Mix 1 µl を混ぜた酵素反応溶液 10 µl を上記サンプルに加えた
4. 30 ℃で18時間反応後、65 ℃で10分間

【使用機器・試薬】

• ウォーターバス

GenomiPhi™ DNA Amplification Kit によるDNA増幅後のステップ

• 1.　マルチプレックスPCR

  GenomiPhi™ DNA Amplification Kit 反応液をカラムShphadex G-50で精製したDNA試料2 ng、10 ng と50 ng をAmpFLSTR Profiler PCR Amplification Kit を使用し下記の条件で反応

  【PCRサイクル条件】

  95℃	11 min
  94℃	1 min	＼
  59℃	1 min		28 サイクル
  72℃	1 min	／
  60℃	45 min
  25℃	soak

  【泳動条件】

  PCR反応液2 µl とloading Buffer 3 µl を加え1 µl をシークエンサーゲルにアプライ

  【使用機器・試薬】

  • マルチプレックスPCR 反応試薬：AmpFLSTR Profiler PCR Amplification Kit (Applied Biosystems™)
  • PCR装置：iCycler (BIO-RAD)
  • 電気泳動装置：ABI PRISM 377XL DNA Sequencer (Applied Biosystems™)

結果

（下記画像をクリックすると拡大表示されます）

結果に対するコメント

• GenomiPhi™ DNA Amplification Kit を使用することで変性DNA試料を増幅することができた
• GenomiPhi™ DNA Amplification Kit による反応を行った鋳型DNAと行っていないDNAを同量使用しマルチプレックスPCRの結果を比較すると、反応を行わないDNAから増幅産物が得られなかったのに対し、反応を行ったDNAからは増幅産物が得られた
• 増幅された産物の増幅効率にバラツキが認められた