High Content Analysis 技術を用いた内臓脂肪細胞の多量イメージング解析

はじめに

糖尿病をはじめとした高脂血症、高血圧症、動脈硬化症などの生活習慣病発症の主要因は、食生活の欧米化に伴う「内臓脂肪」の過剰蓄積であることが、臨床レベルで解明されています。しかし、これまで内臓脂肪細胞の分化誘導系がなく、そのメカニズムは不明な点が多くありました。

ここでは、High Content Analysisを目的として開発されたIN Cell Analyzer 1000を用い、脂肪の蓄積を阻害すると考えられる数種の薬剤を投与した際、VAC01細胞＊の脂肪蓄積にどのような影響を及ぼすか解析しました。

＊VAC01内臓脂肪細胞培養キット
プライマリーセル社（http://www.primarycell.com/）が独自に開発した内臓脂肪細胞の分化誘導系キットです。Indomethacin, dexamethason, PPAR- agonistsなどの分化誘導因子を必要と せず、天然の脂質を添加するだけで、80％以上の細胞が内臓脂肪細胞へと分化します。

 

実験内容

使用した製品

• IN Cell Analyzer 1000
• IN Cell Investigator Software
• Spotfire DecisionSite™ Statistics（TIBCO）＊

＊アップグレードが必要です。

試薬

• VAC01細胞（プライマリーセル社）
• 脂溶性蛍光色素　BODIPY™ 493/503（Invitrogen D-3922）
• Hoechst™ 33258（Invitrogen H-3569 ）
• Packard View Plate（Perkin Elmer 6005182）
• Compound X ※評価対象化合物
• Troglitazone：インスリン抵抗性改善薬として販売されていたが、現在は販売中止。
• Intrafat（日本製薬）：ダイズ油注射液。各種疾患や術前後など に対する栄養補給に用いる滋養強壮薬。糖尿病患者への投与は 禁止されている。

 

実験操作（図1参照）

1. 凍結状態のVAC01細胞
2. 37℃温浴で解凍
3. 細胞を2回遠心洗浄
4. 内臓脂肪分化培地に細胞を懸濁し、コラーゲンでコーティングした96 wellプレートに細胞を播種（10,000 cells/well） ※2日に1回の頻度で培地交換
5. • 培養3日目に10 μM Troglitazone、Compound X、0.1%（v/v）Intrafatおよび Controlとして溶媒を培養液中に添 加し、培養を続ける
   • 培養6日目に培養を終了し、一晩ホルマリン固定
   • 固定した細胞をPBSで2回洗浄し、10 μg/mlのBODIPY™ 493/503（Invitrogen社：D-3922）で20分間染色
   • BODIPY™を除去し、10 μM Hoechst™ 33258 で15分間染色
   • IN Cell Analyzer 1000による画像取り込みおよび画像解析

図1 内臓脂肪細胞に蓄積した脂肪の解析スキーム

 

解析パラメーター

細胞核はHoechst™ 33528による染色、脂肪滴は脂溶性蛍光色素であるBODIPY™ 493/503を取り込ませ検出しました。画像解析ソフトウェアIN Cell Investigator により各パラメーターを算出し評価を行いました（表1）。

表1 IN Cell Investigator で算出した評価パラメーター

 

結果

表現系の変化について

IN Cell Analyzer 1000 で取り込んだ脂肪細胞の透過光画像および蛍光画像を示します（図2）。ソフトウェアによる画像認識で各 パラメーターを数値化し（図3）、薬剤処理サンプルとコントロール で比較を行いました。

図2 IN Cell Analyzer で取得した画像
透過光画像（左）と蛍光画像（右）を示します。青：核（Hoechst™染色）、緑：脂肪滴（BODIPY™ 493/503染色）

図3.　画像解析ソフトウェア（IN Cell Investigator）による脂肪細胞認識
透過光シグナルや各蛍光シグナルをもとに認識部位が枠で囲まれます。しきい値の調整も行えます。

 

インスリン抵抗薬剤であるTroglitazone処理では、脂肪滴数は減少しましたが、細胞核の真円化と面積減少が認められました。油成分を含むIntrafat 処理では、脂肪滴数は減少しているものの脂肪滴面積の増加が確認されました。

評価化合物であるCompound X処理では、コントロールに対して脂肪滴の平均面積が減少し、さらに、脂肪細胞の数が抑制されていることが確認されました。

図4は、薬剤処理サンプルとコントロールサンプル間で各パラメーター変動の傾向を比較したヒートマップです。

 

PCA解析によるパラメーター評価

PCA解析により、IN Cell Investigator で算出した11種のパラメーターの評価を行いました（図5a, b, c）。その結果、「細胞あたりの脂肪滴総面積（Oil Sum Area）」と「細胞あたりの脂肪滴数（Oil Count）」の変量幅が大きく、薬剤評価を行う際に最も重要なファクターであることが示されました。反対に、「脂肪滴の平均蛍光強度」には大きな変化が認められないことがわかりました。

これらから、薬剤が脂肪蓄積に与える影響を評価する場合では、1細胞あたりに占める脂肪滴の面積および数がスクリーニング評価に適したパラメーターであることがわかりました。

図4　各種薬剤が脂肪細胞に与える影響　ー各パラメーターのヒートマップ
※横軸に示される各パラメーター番号については、表1をご参照ください。

 

図5 PCA解析による変量パラメーターの評価
PCA解析を行った結果、細胞あたりの脂肪滴総面積、細胞あたり総脂肪滴蛍光強度がPC(1)において±0.4以上の値を示し、サンプル間の比較に重要なパラメーターであること、また、脂肪滴の平均蛍光強度はサンプル間の相違を評価するうえで特に影響がない値であることが示されました。
※横軸に示される各パラメーター番号については、表1をご参照ください。

 

まとめ

本報で示したIN Cell Analyzer 1000による脂肪蓄積評価では、 取得した細胞蛍光画像から複数パラメーターを一度に算出して統 計解析することで、脂肪蓄積の薬効評価に最適なパラメーターを 選ぶことができました。

このように、細胞蛍光画像をもとにしたスクリーニング解析では、 細胞形状や面積などを評価指標とできることが特長です。High Content Analysis を目的として開発されたIN Cell Analyzer 1000では、鮮明な蛍光画像を取得するとともに、専用ソフトウェ アのIN Cell Investigator、またSpotfire DecisionSite™ Statisticsを用いることで、効率良く精度の高いスクリーニングが実施でき ます。

 

※本研究アプリケーションの開発にご協力いただいた、株式会社プライマリーセル 尾田千佳子様と平敏夫様、日本ティブコソフトウェア株式会社 大石尚孝様に深く感謝いたします。

お問合せフォーム

※日本ポールの他事業部取扱い製品（例: 食品・飲料、半導体、化学/石油/ガス ）はこちらより各事業部へお問い合わせください。