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ガン研究のためのバイオマーカー探索

D, Haid1 , F. Bahram1, A. Jorsback1, O.Ronn1, A. Wanders2 and H. Bergling.
1 Cytiva, Amersham™ Biosciences AB, SE-751 84 Uppsala, Sweden. 2 Department of Surgery, University Hospital, S-751 85 Uppsala, Sweden

はじめに

ガンのバイオマーカー探索に代表される臨床研究や創薬研究において、プロテオミクスの技術が活用されてきています。プロテオミクスの技術には蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動（2D DIGE）技術と質量分析計（MS）を用いた2D-MS、および液体クロマトグラフィー（LC）と質量分析計（MS）を組み合わせたLC-MSシステムによる解析という2つのアプローチ方法があります。

手法

2D-MSのワークフロー

健常者と患者の組織をそれぞれ5人ずつ採取し、凍結させた組織をバッファー（8 M urea、2 M thiourea、4 % CHAPS、30 mM Tris、5 mM magnesium acetate）に溶解し、Sample Grinding Kitを用いて破砕しました。pHを8.5に調整した後、2-D Quant Kitを用いてタンパク質濃度を測定しました。測定したサンプルをCyDye™ Fluorで標識しました。5サンプルから等量ずつ混合したものを内部標準として使用しました。一次元目は24 cmのImmobiline™ DryStripを、二次元目は12.5 %のEttan™ DALTゲルを用いて泳動しました。ゲルを固定化しTyphoon™ 9400（後継機種はTyphoon™ FLA 9500）で画像を検出、DeCyder™ 2D ソフトウェアにより解析し、発現量に差のあったスポットをピッキングしてトリプシン消化し、Ettan™ MALDI ToF-Proで同定しました。

MDLCワークフロー

健常者と患者のサンプルをアルキル化、トリプシン消化した後にEttan™ MDLCおよびイオントラップ型質量分析計Finnigan™ LTQ（Thermo Electron）で解析しました。1 µgのサンプルをイオン交換カラム（2.1×250 mm SCX、BioBasic、 Thermo Electron）に添加し、塩化アンモニウムでステップ溶出した後に、トラップカラム（0.3×5 mm, Zorbax™, Agilent™）に吸着させ、さらに逆相カラム（0.075×150 mm, Zorbax™, Agilent™）を用いる2次元のクロマトグラフィーで分離しました。逆相分離はA液：0.1 % ギ酸およびB液：84 %アセトニトリル・0.1 % ギ酸を用いて、0～60 % Bを60分のリニアグラジエントで行いました。デュアルカラム（2セットのトラップ・分離カラム）により、LC-MS測定と次回の測定に用いるカラムの平衡化を同時に行いました。MS分析はFull MS/Zoomscan/MS/MSのTriple Play Modeで行いました（on the three most abundant ions）。Dynamic exclusionは30秒で測定しました。タンパク質の同定には、X! Tandem検索エンジンを使用しました。

※Ettan™ MALDI ToF-Pro、DeCyder™ 2D ソフトウェアは販売終了しておりますが、参考情報として掲載しております。

結果

2D-MSのワークフローで得られた結果

2D-MSで得られた二つのゲルを比較したところ、発現量が異なるスポット（p-value<0.01）が69個見つかり、39のタンパク質由来であることが分かりました。DeCyder™ EDAの解析で39個のタンパク質を、1)構造タンパク質 2)転写因子、3)シグナル伝達物質。9つのタンパク質の3つのグループに分けることができました。これらのうち9つのタンパク質はすでに他のガンで見つかっているものでした。

ガンおよび正常組織のゲルの比較

図1 ガンおよび正常組織のゲルイメージの比較
ガンに関与していると思われるタンパク質のスポットの位置を示しています。発現量の違いは右側の3Dの図で視覚的に確認できます。ピンク色で示されているタンパク質スポットはp-valueが0.001以下でした。

図2 DeCyder™ソフトウェアのBVAモジュールのスクリーンショット（上）

図2 DeCyder™ソフトウェアのBVAモジュールのスクリーンショット（下）

図2 DeCyder™ソフトウェアのBVAモジュールのスクリーンショット
上：発現量の異なるタンパク質のグループ分けおよび関連パスウェイ
下：ACTG-1遺伝子（p-value 0.019）産物のパスウェイ

表1 同定されたタンパク質の情報
発現量に違いのあったタンパク質のうちいくつかはすでに機能が分かっていました。また、他のガンでもマーカー候補として知られているものでした。

pH3-7
Protein name	p-value	Gel annotation	Function
Selenium binding protein	0.0008	3	Selenium binding(Cancer suppressor)
Vinexin beta	0.0009	6	Cytoskelletal regulation, kinase
PDZ and LIM domain 1	0.0038	1	Kinase, actin dynamics, cell death regulation
Proapolipoprotein 1	0.0049	4	Unknown
Intersection 1	0.0063	5	Cellular transformation, actin nucleation
NOD 2	0.0079	2	Immune response

pH6-11
Protein name	p-value	Gel annotation	Function
Kallikrein	<0.01	3	Serin protease
Enolase	<0.01	6	Diverse
TKT protein	<0.01	1	KEGG pathway

MDLCワークフローで得られた結果

MDLC-LTQで得られたMS/MSスペクトルを用いて、Tandem searchアルゴリズムにより、ヒトのデータベース検索を行いました。健常者サンプルでは174個、ガン患者のサンプルでは270個のタンパク質が同定されました（p-value<0.05）。興味深いことに、MDLCワークフローで見つかったバイオマーカー候補は、2D-MSワークフローでは見つかりませんでした。

表2 MDLCワークフローの結果。すでに機能が判明している腫瘍マーカーをピックアップしています。
Only present in normal tissue	Only present in cancer tissue
Alpha-1-antitrypsin precursor (Alpha-1 protease inhibitor) (Alpha-1-antiproteinase) (PRO0684/PRO2209)	heat shock 90 kDa protein 1, alpha; heat shock 90 kD protein 1, alpha [Homosapiens]
heat shock protein 90-beta [validated] - human	TPM4-ALK fusion oncoprotein type 2 [Homo sapiens]
Aldose Reductase (E.C.1.1.1.21) Complex With NADPH	colligin-2 - human
GTP binding protein Rab 1a	Chain C, Structure Of The Karyopherin Beta2-Ran Gppnhp Nuclear Transport Complex
chaperonin 10-related protein [Homo sapiens]	RAB6B, member RAS oncogene family; small GTPase RAB6B [Homo sapiens]
Protein kinase C substrate, 80 kDa protein, heavy chain (PKCSH) (80K-H protein)	GTP-binding protein Rab4 - human

結論

●2D DIGE解析により9個のガンのバイオマーカー候補が見つかり、機能的なグルーピングが行えました。

●MDLC-LTQからガンに関連する12種類のタンパク質が見つかり、non-differential MDLCがバイオマーカー探索に利用できることがわかりました。

●2つのワークフローで共通のバイオマーカー候補が見つかっていないことから、今後はゲルベース・LCベースの一方の技術だけではなく、両方の技術を用いた探索の必要性が示唆されました。

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