Cytiva Webinar Ondemand

チップは出した時に、新しいバッファーで洗わなくてよいのですね？例えば、バッファーではなくミリＱ　水での洗浄はありですか？

今回でのデモではリユースのセンサーチップを使用しましたが、新品を開封した際は、バッファーや水で洗浄していただく必要はありません。 センサーチップをセットした後にランニングバッファーで平衡化をしていただきます。

結合のみを見るときは実測Rmaxが高くなる様にリガンドを固定化した方が良いのでしょうか。

十分にレスポンスがみられる程度に固定化をして下さい。カイネティクス解析のように低く抑える必要はありません。

センサーグラムのスパイクは除いてから解析するのが望ましいのでしょうか。

場合によりますが、フィッティング時にRIとして計算されてしまう場合などでQuality Controlがパスしないなどのケースでは除いていただくと良いです。

キャプチャー法を用いてアフィニティ解析を行う場合、サイクルごとにリガンドの固定化量が微妙に異なりますが、解析に影響はないのでしょうか？

はじめにシングルサイクルカイネティクスの場合は、一度のキャプチャーで濃度5点のアフィニティー解析が行えますのでベースラインドリフトが強くない限り影響はありません。それ以外の場合マルチサイクルカイネティクスを採用しますが、一度の測定で同一濃度のアナライトを2回ずつ流してみるなどして、再現性確認の実験を行ってみるなどで影響がないかご確認ください。

溶媒補正時に15バイアル内でサンプル数は十分に測定できるでしょうか。

少なくとも5濃度1サンプルのサンプルを測定するために、アミンカップリングによる直接法やSensor chip SAを用いた実験系などでは特に問題はありません。その他キャプチャー法を使用した場合、スタートアップの回数を削るなどで、最低でも溶媒補正に４点以上の溶媒濃度を設定してください。また、DMSO溶媒補正用の濃度点数を減らす際には補正検量線用の標品のDMSO濃度レンジを適切な範囲でなるべく狭くしてください（同時にサンプル調製を気を付けてください）。

NTAのセンサーチップで、Hisタグを付加したタンパク質を固定化して、低分子化合物の結合を検出するのは難しいと聞いたのですが、理由はなぜなのでしょうか？

NTAチップ表面に対してキャプチャーされたHisタグタンパク質は、それほど親和力が強くないため測定中に徐々に解離して右肩下がりにドリフトする場合があります。正確な相互作用測定のためにはキャプチャー後安定なベースラインが保たれることが必要です。
ある程度ブランクを差し引くことでベースラインはフラットにすることはできますが、ドリフトが大きい場合は溶媒補正のデータの誤差範囲も大きくなりますので、その場合はお勧めできません。このドリフトを抑えるために、以下の3法がキャプチャー法としての代表的な対応になります。

１）キャプチャー量を低く制御する。
ある程度解離すると空いたNTA-Ni表面に一度外れたHisタグタンパク質が再結合するため、見かけ上安定化します。しかし分子量の小さい低分子を測定したい場合は結合レスポンスが小さすぎることもあります。

参考資料

２）NTAクロスリンク。
Sensor Chip NTAは Amine Coupling kit と併用して共有結合させベースラインを安定化させるクロスリンクという固定化方法があります。ただし、こちらの手法ではリガンドの付け替えができなくなります。

３）Biotin CAPture kit。
今回のWebinarのようにBiotin化をしていただければ、安定なベースラインを確保しやすくなります。ただし２）と比較すると固定化量は低くなります。
参考資料

濃度を濃くしていったときにリガンドとアナライトとの非特異的相互作用がある場合、あるいは基板表面との吸着がバックグランドに生じる（リファレンスと差が生じる）場合、どのように解析処理したらよろしいでしょうか？

非特異的結合を解析上で補正することは困難ですので、サンプル側の調整が必要です。濃度帯を低濃度側にずらしていただく。DMSOが低濃度でアナライトが溶けにくい場合は5%程度まで上げていただく。固定化時にタンパク質が変性してしまうことが非特異につながるようであれば固定化方法を変更する。非イオン性界面活性剤やEDTAが添加されたRunning bufferを使用するなどご検討ください。

平素より大変お世話になっております。理論的 RU 値から考えられる 具体的な 濃度の算出はどのように計算致しますでしょうか。

理論的Rmaxでよろしかったでしょうか？このRU値から測定に用いるアナライトの濃度を見積もることは理論上できません。アナライトの適切な添加濃度は得られるKDによって決まります。が現実上KDが未知の状態で条件検討しますので、レスポンスがギリギリ観察できるレスポンス高からRmaxに近いレスポンス高が得られる添加濃度・時間を設定してください。

お問い合わせありがとうございます。
後ほど担当者よりご連絡させていただきます。