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サイズセレクションがより良い次世代シーケンサー（NGS）データをもたらす

By Andrew Gane, Genomics & Diagnostics Strategy & Technology Manager

高品質のライブラリーは、次世代シークエンシングのコストを抑え、使用可能なデータを最大化するための鍵です。サイズ選択によってデータ品質がどのように改善されるか、およびライブラリ作成ワークフローで使用できる方法について詳しく見てみましょう。

NGSサンプル調製、コスト、およびデータ品質

次世代シークエンシング（NGS）技術の導入は、ゲノムへのアプローチにおいて根本的な変化をもたらしました。今でも、第2世代のシーケンサーが登場してから10年以上経っても、市場は成長し続けています。

これは、シークエンシングのコストを削減し、技術をより多くの研究者やアプリケーションに開放するという絶え間ない努力によるものです。これらは前年よりコスト削減されているにもかかわらず、個々のシークエンス実行は依然として高価です。アップストリームのライブラリー構築とサンプル調製ステップを最適化することで達成できる、任意の実行からの使用可能なデータを最大化することは、さらなる節約につながる可能性があります。

これらのプロセスは比較的安価であり、最終的なデータ品質に大きな影響を与えます。ライブラリフラグメントサイズの選択がデータ品質への重要なステップである理由はここにあります。そしてサイズ選択を実行するための主な方法、それらの長所と短所についてのご紹介いたします。

典型的なNGSサンプル前処理はどのようなものですか？

シークエンシングには複数のアプローチがありますが、イルミナのシンセシスバイシーケンシングアプローチは今でも、最も普及しています。これまでに、NGSサンプル前処理の基本について説明してきました。これには、ライブラリを構築するための一般的な手順がいくつかあります。

  • 酵素的または機械的手段による断片化
  • 異種断片末端を均質化するための末端修復および処理
  • クラスター生成と細胞内クローナル増幅のためのアダプター連結
  • 最適以下のフラグメントサイズおよび任意のアダプターダイマーを除去するためのサイズ選択

サイズ選択の重要性

ゲノム配列決定は高品質のライブラリーを有することに依存しています。その一環として、ライブラリのフラグメントサイズが特定の機器に対して最適な範囲内（通常、Illumina™システムに対して200～500 bp）になるようにしています。この範囲は、クラスター生成に対する断片長の影響および配列決定プロセス自体の効率の結果です。

小さな断片は、大きな断片よりもフローセル上でより効率的にクラスター化する傾向があります。より小さなフラグメントへの偏りは、配列決定能力の多くを未使用のままにします。150 bp未満のフラグメントサイズを選択すると、不要なアダプターおよびプライマーダイマーのキャリーオーバーが発生する可能性があり、その配列決定は多くの使用不可能なデータおよびさらに容量の無駄につながります。

最適よりも大きいフラグメントは逆の課題をもたらします。1 kbを超える長さのフラグメントをシーケンスすることは可能ですが、これは非効率的でエラーが発生しやすく、第3世代のシーケンスが解決しようとする問題です。

個々のサンプルは、狭い分布から広い分布まで、さまざまなシーリングプロファイルを持つこともあります。たとえば、200～1,000 bpの分布がある場合に機器を600 bpフラグメントに設定すると、多くのシークエンステンプレートが実行可能にならず、十分な深さまで読めなくなります。これは有用なデータをほとんど生成せず、カバレッジの均一性が低くなります。

サイズ選択ステップにより、ランダムに断片化されたライブラリーを取得し、機器とアプリケーションに最適な/ターゲット範囲に適合する断片のみを引き出すことができます（図1）。これにより、シークエンスランの効率が最大化され、時間とコストが節約されます。


図1.二重サイズ選択による酵素断片化DNA

DNA断片化法に関するノート

断片化にはさまざまなオプションがあり、その中にはサイズ選択の必要性を完全に回避することを試みるものもあります。方法の選択は、用途、出発材料、および利用可能な機器に依存します。

酵素的方法は完全に無作為ではない傾向がありますが、様々なインキュベーション時間を通して断片サイズをある程度制御します。しかしながら、これらは、重複フラグメントを少なくする可能性があるため、デノボ組み立てにはあまり適してはいません。

超音波処理または集束音響技術を使用する、機械的シーリングのためのさまざまなオプションがあります。これらはランダムであり、予測可能なシーリングプロファイルを作成するように調整できます。

サイズ選択方法

サイズ選択へのアプローチは、酵素的方法、ゲルベースの方法、および磁気ビーズベースの方法を含み、それぞれの適合性は実験の必要性に依存します。これらはまた、アダプター二量体および他の任意の残りの試薬を一掃する機会を提供します。

酵素的アプローチ

IlluminaのNextera™キットは、Illuminaテクノロジーと互換性のあるさまざまなアプリケーション用のライブラリーを1ステップで作成します。

発足時には、トランスポゾンベースのフラグメンテーションとタグ付け（「タグ付け」と呼ばれる）を使用してサイズ選択の必要性を回避しようとし、いくつかのワークフロー手順を省いていました。ただし、ライブラリのプロファイルは広くなる傾向があり、ユーザーは別のサイズ選択手順に戻ることがよくありました。

Nexteraキットには、磁気ビーズベースのサイズ選択試薬が含まれています。

ゲルベースのアプローチ

ゲルは核酸精製に長い間使用されてきたため、選択したフラグメントサイズを物理的に除去することができます。SageのPippin Prep™などのゲルベースのシステムは、このプロセスの自動化に役立ちますが、本質的にスループットが制限されています。典型的な96サンプルバッチは、処理に10時間近くかかります。

磁気ビーズベースのアプローチ

便利でハイスループットなサイズ選択とクリーンアップのための磁気ビーズの導入は、この成功に不可欠なCytivaのSera-Mag™粒子を使用して、NGSワークフローを変革しました。

もともとPCR産物の単離用に開発されたこれらのビーズは、マグネタイトとカルボキシル分子の層で覆われたポリスチレンコアを持っています。ポリエチレングリコール（PEG）と塩の存在下で核酸は可逆的に結合します。固相可逆的固定化として知られる方法です。

ビーズは、他の点では不活性であり、大きな表面積のために高い結合能を有します。結合したフラグメントのサイズは、単純にDNAに対するPEG／塩／ビーズの体積比を変えることによって調整することができます。実用的な観点からは、このビーズ化学により、非常に特定の範囲のフラグメントを一貫して再現可能にサイズ選択することが簡単になります。

磁気ビーズベースのアプローチは、自動化を伴うハイスループットアプリケーションに非常に適しており、そして試薬のコストも他のアプローチと比較して低いです。これらの特性により、磁気ビーズはNGSサンプル前処理を最適化するための簡単なソリューションとなります。

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