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次世代シークエンシングのマルチプレックス法の課題に取り組む

By Andrew Gane, Genomics & Diagnostics Strategy & Technology Manager

マルチプレックス化の必要性

次世代シークエンス（NGS）は高速です。全ゲノムを配列決定することができるランは、ヒトゲノムプロジェクトに必要とされる日数または年数ではなく、数時間で測定されます。NGSテクノロジの容量と可用性もこれまで以上に大きくなり、1回の実行で何億ものデータが何億ものギガベースのデータを生成します。

単一のゲノムシークエンシング実験はそのような莫大な容量を必要としませんが、ほとんどの読み取り深度のニーズはその容量のほんの一部で適切にカバーされます。個々のランのコストは依然としてかなりのものであるため、数百または数千のライブラリをマルチプレックス化することによってこの全容量を利用することにより、ゲノムのシークエンシングのコストを引き下げることが可能になります。

ただし、マルチプレックス化には課題がないわけではありません。インデックスの割り当てミスと並行したサンプル前処理の課題を解決し、ワークフローとデータ品質の両方を向上させ、最終的に1サンプルあたりのコストを削減するためにどのように対処できるかを見てみましょう。

多重配列決定に伴う課題

各シークエンス実行を可能な限り生産的にするという目標にもかかわらず、ワークフローのスケールアップを伴うアプローチでは、いくつかのユニークな課題が発生します。NGSマルチプレックス化の場合、これらはライブラリー調製および配列決定データ分析段階の両方に見出すことができます。

インデックスの割り当てミス

マルチプレックス化では、プールして単一のパターン化フローセルで実行する前に、各ライブラリにインデックスバーコードでタグ付けする必要があります。これにより、各ライブラリーの読み取り値を識別し、ソフトウェアによってバルクシークエンスデータから分離することができます。これはほんの一握りのライブラリ、またはそれぞれが一意のインデックスを持つ数千のライブラリにすぎません。

しかし、時にはインデックスが誤って割り当てられているため、あるライブラリの分子の読み取りが誤って別のライブラリに割り当てられているため、分析が複雑になります。これらの出来事はごくまれです（おそらく1〜2％、10％にも達することもあります）。含まれる膨大な数を考えると、これは割り当てミスが要因であることになります。

これは、低頻度の対立遺伝子検出において、真と偽の陽性を区別することが不可能であるかもしれない、あるいはサンプルが乏しいかもしれず、そしてあなたが収率を最大にする必要がある場合に特に問題です。

インデックスの割り当てミスへの取り組み

インデックスミスアサインメントは、「インデックスホッピング」、汚染している遊離アダプターおよびインデックスプライマーがフローセル中のクラスター化分子に結合すると考えられるプロセス、に主に起因します。これらはクローナル増幅中に拡大し、他のライブラリーのインデックスでリードを作成することができます。IlluminaとNGSコミュニティが実施したテストによると、インデックスホッピングは、以前のブリッジ増幅法と比較して、IlluminaのExAmpクラスタリング化学でより一般的に見られます。

割り当てミスはよく知られた問題であり、現在は主にデュアルインデックスと固有の分子ID（UMI）の使用によって対処されています。このアプローチにより、ソフトウェアは、デュアルインデックスまたはUMIの正しい組み合わせを持たない読み取りのデータを破棄することができます。

並行サンプル調製

マルチプレックス化のための複数の個々のライブラリーの並行サンプル調製は、余分な時間とリソースを必要とし、そして潜在的なエラーの原因を追加します。

サンプル前処理における課題はもちろん新しいことではなく、その作業はマルチプレックス化率によってさらに複雑になります。数日前に手動で少数のライブラリを準備することは、ほんの数年前に受け入れられました。さて、サンプルあたりの競争力のあるコストを維持するには、その間に数百または数千のサンプルを準備する必要があるかもしれません。高品質で再現性のあるデータを生成するために、すべてのライブラリーに対して念入りに正確な定量、フラグメントサイズの同定、および正規化を実行している間、これはすべてです。

サイズの異なるフラグメントを使用してライブラリを多重化すると、サイズの大きいフラグメントよりも小さいフラグメントをより効率的に順序付けることに自然な偏りがあるため、読み取り深さに矛盾が生じます。そのため、プールはできるだけ正確である必要があります。

時間、リソース、または機器の制限のために定量方法に違いがある場合は、同じサンプルソースを使用した同じ実験で異なる品質のデータが生成される可能性があります。分光光度法のような単純で迅速な方法は十分に正確ではなく、そしてプライマーおよびヌクレオチドを含むすべての核酸を定量します。電気泳動法はサイズ決定には良いですが、定量化には信頼性がありません。理想的には、qPCRを使用しますが、これは時間がかかります。

正規化も誤差の原因であり、多くの場合10 µl未満の量を慎重かつ正確に取り扱う必要があります。ここでの小さなエラーやユーザー間のばらつきはデータの品質と信頼性に影響を与えます。特にサンプルが少ない場合は、準備とプールを繰り返すことが必ずしも容易ではありません。

そのため、データ品質を犠牲にしない、より実用的なワークフローが必要です。

サンプル前処理の課題を解決する

ある程度の自動化は、並行試料調製に関する問題のいくつかを軽減するのに役立ちます。しかしこれは、空力的に効率的ではなく、より強力なエンジンを車両に搭載するのとよく似ています。ワークフローを改善することはより理にかなっていると言えるでしょう。すべてを並行して処理するのではなく、早い段階でライブラリをプールしてまとめて処理する方が現実的です。これは理想的な解決策であり、全体的な作業負荷を減らし、そしてユーザによってもたらされるサンプル間の変動を最小にします。

このアプローチを成功させる鍵は、ライブラリの簡素化または自動バーコード化と正規化、およびデータ品質の妥協を避けるための入力量の変動に対する高い許容度です。例えば、各ライブラリーについての単純な分子タグ付け工程は、等モル量の断片を引き出すことができました。これにより、個別の定量化と正規化の手順が不要になり、簡素化して既存のワークフローに簡単に統合できます。

私たちは、マルチプレックスライブラリー調製の課題を解決するために取り組んでいます。私たちの目的は、高いデータ品質を維持し、サンプルあたりのコストを削減し、専門知識やリソースを必要としない実用的なワークフローを開発することです。

私たちのゲノミクス専門家は、すべてのNGSワークフローにおいてサポートすることができます。NGSのワークフローとアプリケーションについての詳細は、他のNGSブログを読んでみてください。

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