1.Method definitionの作成

通常の方法に則りMethod definitionを作成してください。

Figure 1

ポイント：stepとcommandを理解する

Stepは赤枠で示された部分です。Figure 1ではAnalysisが選択されています。一方、commandは青枠で示された部分です。Figure 1ではAnalysisのstepで実行されるcommandが示されています。この後に続くSample position importでは、以下のルールに従ってプレートのウェルを埋めていく必要があります。

  • A) ひとつのstep内のcommandで使用する全ての溶液（要は青枠内の全ての溶液）は1枚のtray内に収まること。別のstepで使用する溶液は別のtrayに準備しても構わない。

Trayとは？

Figure 2

この銀色の平板がtrayです。1枚のtrayには2枚のplateを載せることができます。盲点になりやすいのがSingle cycle kineticsなどのcommandで、この場合複数の濃度のサンプルを充填するウェルが必要になりますが、これらは全て1枚のtrayに存在しなければなりません。

なお、Biacore™ 8Kは2枚のtray（＝4枚のplate）、Biacore™ 8K+は6枚のtray（＝12枚のplate）をマウントさせることが可能です。この後に続くSample position importではそれぞれのtrayやplateの名称を変えることも可能ですが、分かりやすくするため、上から順にtray1, 2, 3, …とし、また左上から順にplate 1, 2, 3,…としてしまった方が良いでしょう（Figure 3、Biacore™ 8K+の場合）。

Figure 3

  • B) 複数のstepを利用している場合（またほとんどの場合そのはず）、それぞれのstepごとにサンプルポジションをインポートするExcelシートを作ること。

必ずしも全てのstepのサンプルポジションを設定しなくともよい

例えばFigure 1ではConditioning, Startup, Analysis, Solent correctionの4つのstepがありますが（Solvent correctionはAnalysisに紐づいていますが別のstepです）、Analysis以外のstepに関してはそれほどplateに溶液を充填することはないと思われます。このような場合はAnalysisのstepのみサンプルポジションを設定し、その他の溶液についてはVariables and positioningにて手動で（クリック&ドラッグ。異なるtrayにもドラッグできる）位置決めをするなど、ハイブリッドに設定していただくことをお勧めいたします。特に、次の項目の「Repeat withinで紐づけられたstepはサンプルポジションを指定できない」という例外ルールがあるため、基本的にはAnalysisのstepのみご対応いただく方が良いかと思います。

Repeat withinで紐づけられたstepはサンプルポジションを指定できない

Figure 1のSolvent correctionに関してはAnalysisのstepに紐づいており、この場合ですとAnalysisのstepが始まる最初と最後、さらに48サイクルおきにsolvent correctionのstepが組み込まれるように指定されています。例えばAnalysisが50サイクル分あるのであればSolvent correctionは3サイクルになるのですが、50サイクルという数字自体も次のVariables and positioningのタブで初めて設定されるものであり、この3サイクルという数字は残念ながら装置の方で認識できません。したがってRepeat withinで設定されたstepに関してはサンプルポジションを指定することができず、手動にて（クリック&ドラッグ。異なるtrayにもドラッグできる）設定していただく必要があります。

Tips：

2章のVariables and positioningに関しては、デフォルトではFigure 14に示されるルールでポジショニングされています。例えば緑色破線のように「1枚のtrayの左側のplateの下から上の順」のように設定されています。どこから充填をスタートするかはご自身で指定することも可能であり、本資料のようにsample position importの方法を用いずともある程度はこちらで対応できます。

水色破線については少しトリッキーで、例えば5濃度のsingle cycle kineticsを考えてみます。96 well plateは12行のウェルがありますので、5濃度分が1セットと考えると2セットのSingle cycle kineticsを実施すると2行分のウェルが空きます。ここで3セット目を準備する際、デフォルトの設定の場合は空いた2行分のウェルに充填せず、次のplateの1行目に充填されます。これはFigure 14の水色破線に示されたKeep concentration series together within plateにチェックが入っているためです。この項目にチェックが入っていると、サンプルの濃度が異なる溶液などの並び順がplate間で同じ配置になり、間違いにくいよう配置される仕組みになっています。

2. Variables and positioningでのsample position import

初期画面の見方について

ここではAnalysisのstepについて確認します。始めに、Show more columnsのチェックボックスにチェックを入れてください（Figure 4）。Figure 4の破線赤枠内がNo.1、破線緑枠内がNo.2を表しており、8行で1セットになっていることが分かります。上から順に、Needle 1, 2, 3, …, 8が吸引・添加する溶液を示しています。Figure 1の青枠内をご確認いただくと分かりますように、この溶液は左から順にGeneral 1, Capture 1, Single cycle kinetics 1（5濃度分）, Regeneration 1, Wash 1, Wash 2のcommandで添加される溶液が並んでいます（バーをドラッグして右端まで動かせばご確認いただけます）。No.1を左から順に添加し終わったらNo.2を左から順に添加していきます。前章のルール(A)で示したように、各No.で添加する全ての溶液は1枚のtray内に収まっている必要がありますが、左右のplateのどちらに置かれていても問題ありません。またNo.番号が異なれば異なるtrayを利用することも問題ありません。Figure 5を見ると、今回は5濃度のSingle cycle kineticsの動作だったので、plate 1の5行のウェルにSingle cycle kinetics 1、plate 2にGeneral 1, Capture 1, Wash 1, Wash 2のcommandの溶液がそれぞれ充填されていることが分かります。

Figure 4

Figure 5

【補足】破線赤枠内はAnalysisのstepにおけるNo.1で使用される溶液全てを示しています。この溶液は1枚のtrayに充填されていなければなりません（ルール(A)）。

Sample position importの方法

  • Show more columnsのチェックボックスにチェックを入れます。
  • サンプルポジションをインポートしたいstepを選択します（Figure 6ではAnalysisが選択済み）。
  • ①サンプル名などが記載されている適当な領域を1回左クリックし、Ctrl+Aで全領域選択、続いてCtrl+Cでコピーしてください。コピー後は②Remove all cyclesで情報を消してください（白紙になります）。

    Figure 6

  • Microsoft Excelを立ち上げ、一番下のsheet名をAnalysisなどに変更してください。
  • コピーした内容を該当のsheetに貼り付けますが、上2行はこの後記入するためA3セルを起点として貼り付けてください（Figure 7）。

    Figure 7

  • Control Software内の黒いバーの情報（Figure 6の破線赤枠内）を1行目と2行目の対応する場所に書き込みます（Figure 8）。1行目（commandに相当します）は空白も全て記載すると後々の確認が楽になります。記載した部分を赤文字で示しました。

    【注意①】 Noのカラムは自動で設定されるため記入は不要です（Figure 8内では理解のため入れました）。また赤文字の部分はこの後のインポート時に理解のために入力しているだけなので、図のように省略した言葉などで構いません。

    【注意②】 Controlのタグはsample position importに対応しておらず、インポート後に手動で設定し直す必要がありますので、ここでは無視してください。

    Figure 8

  • 全てのcommandの列の左隣に空白の列を挿入し、1行目に挿入されたcommand名を、2行目にplate idと記入してください（Figure 9）。記載した部分を青文字で示しました。

    【注意】 1つのcommandにつき1つのplate idの列を挿入してください。下の例ではSCK1というcommandに対して1つのplate idの列が挿入されています。

    Figure 9

  • お好みのplateとpositionを記入してください（ウェル名は小文字でも構いません（A1でもa1でも可））。デフォルトで入っているpositionの情報は消して構いません。新たに入力し直したセルについて緑文字でFigure 10に例を示しました。

    Figure 10

    【注意①】 初期のペーストしたエクセルファイルではplateとpositionが同じセル内に入っていますが（例えばFigure 9のC3セルなら「Plate 2 A1」）、この後Biacore™ 8K Control Software内にインポートするためには別のセルで管理する必要があります（例えばB3セルにはplate2、C3セルにはa1のように記入する）。Excel 2013以降の新機能であるフラッシュフィル機能（入力されたデータから規則性を自動的に認識して実行してくれる機能）を利用したり、オートフィル機能を利用して再入力してください。なおplateの後のスペースは不要です。

    【注意②】 同じSolutionであれば同じウェルを指定することが可能です。Figure 10のC3セルとC11セルをご確認いただきますと、同じBiotin CAPture Reagentが同じウェル内に指定されています。この場合は溶液がプールされることになります。もし該当の溶液が一つのウェルに収まりきらない場合、Biacore™ 8K Control Softwareにインポートしたときには自動で別の空いたウェルに入りますが、サンプルのレイアウトが崩れますのでご注意ください。また、同じウェルから複数回サンプルを取得する場合は大容量のplateやセプタ（code 29192561）が必要になることにご注意ください。

    ※セプタはゴム製のプレートシールです。同じウェルからサンプルを吸引・添加する際は乾燥防止およびコンタミの抑制のためセプタを利用することを強く推奨します。セプタは96 well plateのみのご提供です。

    【注意③】 再生溶液などは多くのウェルを使用してしまうため、plateのウェルに充填するのではなくReagent bottleを利用することがあります。この場合、positionのセルにReagent bottleと入力しておけば良いです。plateの列は不要ですので削除してください。

  • Excel上のB1セル以降を全選択し、Ctrl + Cでコピーします（Figure 10）。No.の列は不要です。
  • Biacore™ 8K Control Softwareに戻り、サンプル情報やポジション情報が全て空白になっていることを確認したら（3.の操作のRemove all cycleで空白になっているはずです）、Clipboardをクリックします。なお空白にしていない場合はRemove existing cycle in stepにチェックが入っていれば上書きされます。

    Figure 11

  • Figure 12を参考にしてください。

    • ①1行目のチェックを外します。
    • ②直上の表記をプルダウンから選択します。全ての列で行います。スライドバーをドラッグしてください。
    • ③直下の表記をプルダウンから選択します。全ての列で行います。もしプルダウンに選択肢がない場合はIgnoreを選択します。

    Figure 12

  • 続いてtrayとplateを正しく選択します（Figure 13）左右の位置やtray番号、プレートのタイプを間違えないようにしてください。trayとplateの関係はここで変えられますが、混乱を避けるためFigure 3の配置に従うことを強く推奨します。また、手順8の【注意②】でも述べましたが、pooling設定のためにdeep well plateを使用する場合は必ず対応したtypeを選択してください。一つのウェルに入りきらない場合は自動で空いたウェルに用意されますが、レイアウトが崩れます。

    Figure 13

  • Import into methodボタンを押せばポジション情報がインポートされます。
  • Controlタグを付けたい場合は手動で設定してください。サンプル名をBlankなどとしている場合、勝手にBlankのタグが付いていることがありますがバグですので修正してください。
  • 今回はAnalysisのstepに対してサンプルポジションのインポートを実施いたしましたが、別のstepに対しても実施する場合は同様の操作を繰り返してください。ただし繰り返しますが別のstepに関しては手動で（クリック&ドラッグ。異なるtrayにもドラッグできる）位置決めをした方が便利です。この際、歯車マーク内のPrevent auto-rearrangeをクリックしてから手動で移動させてください（Figure 14）。これは、もともとサンプルポジションに関しては自動でポジションを整列する機能が備わっているためです（【Tips】参照）。

    Figure 14