Biacore™SPRシステムによる
タンパク質分解誘導剤（PROTAC）三元複合体形成の特性評価

はじめに

1.1 PROTACの背景

Proteolysis Targeting Chimeras（PROTACs）は、細胞のタンパク質調節機構を乗っ取ることで、標的タンパク質のプロテオソーム分解を誘導することができる低分子化合物です。PROTACは、標的タンパク質結合部、E3ユビキチンリガーゼ結合部、および両者をつなぐリンカーの3つの部位から構成されています。PROTACは、標的タンパク質とリガーゼが同時に結合し、標的：PROTAC：リガーゼ三元複合体となることで、標的タンパク質をユビキチン化し、プロテオソーム分解に向かわせます。

薬物設計において、PROTACを使用することは、治療上いくつかの利点があります：

1.2 PROTAC三元複合体の生物物理学的側面

PROTACの作用機序には、安定性の高い三元複合体を形成することが重要である。より長く持続する三元複合体は、より高レベルのユビキチン化と、より速いタンパク質の減少速度に関連します。三元複合体の安定性は、PROTACの各タンパク質結合パートナーへの親和性だけでなく、複合体形成時に標的タンパク質とリガーゼ間のde novo プロテイン-タンパク質相互作用 (PPI) も導き出されます。

新たに形成されたPPIが良好な場合、PROTACがリガーゼとあらかじめ結合しているときの方が、PROTAC単独よりも標的タンパク質の親和性が高く、その逆もまた然りです。cooperativity factor（α）は一般に、de novo PPIがどれほど有利か不利かを示す良い指標となります。cooperativity factorは、PROTACに対する標的の結合親和力(K_D)を、リガーゼとプレコンプレックスになったPROTACに対する標的のK_Dで割って算出します（Fig 1）。

Fig 1. PROTAC三元複合体を形成する2つの可能な経路を示す模式図。cooperativity（α）は、一方のタンパク質結合パートナー（標的またはE3リガーゼ）のPROTACへの結合親和性を、もう一方のタンパク質結合パートナーとの飽和濃度存在下でのそのタンパク質結合パートナーのPROTACへの親和性で割ることによって計算することができる。

高い協同性を持つ複合体を形成するPROTACは、しばしば三元複合体において、構成する標的バインダー単独よりも高い親和性で標的タンパク質と結合します。さらに、三元複合体形成時に誘導されるPPIは2つのタンパク質の広い表面積に及ぶため、結合部位全体のタンパク質配列のわずかな違いにも協同性が影響を受ける可能性があります。この結果、PROTACは、構成する標的バインダーがホモログに対する特異性を示さなかったとしても、標的特異的な分解を示すようになることがあります。

Table 1. PROTAC三元複合体の生物物理学的パラメータのまとめ

Binary affinity	標的タンパク質とリガーゼの両方に対する親和性が、標的との係わり合いに重要です。化合物が協同的であれば、二元的な親和性の不足を取り戻すことができる可能性があります。
Cooperativity	二元系と三元系の複合親和力の比として測定されます。アイソフォームやバリアント特異性を持たせるためには、協同性が特に重要です。
ΔGcomplex	三元複合体を形成することが全体としていかに有利であるか。
t1/2	PROTAC三元複合体の安定性は、PROTAC開発時の重要な最適化パラメータです。より長持ちする複合体は、標的のユビキチン化を促進し、結果として標的の分解を早めます。そのため、科学者にとって、3つの複合体の結合と解離の親和性と動態を確実に測定する方法は非常に重要です。
Positive confirmation of ternary complex formation	PROTACが強い協同性を示す場合、ポジティブな結果が期待できますが、三元複合体の形成を直接「観察」できるアッセイを使用して検証することが重要です。これは特に非協同的でネガティブな協同性を示すPROTACにおいて注目すべきです。
Binding stoichiometry	ターゲット：PROTAC：リガーゼの3元複合体は、一般に1：1：1の化学量論に従う。

1.3 PROTAC三元複合体のモニタリングのための生物物理学的手法

近年、三元複合体の形成機構をプロファイリングする生化学的・生物物理学的手法がより多く開発され、それぞれの手法には利点と限界があることが分かっています。今日の科学者は、蛍光偏光法（FP）、時間分解-蛍光共鳴エネルギー転移法（TR-FRET）、AlphaScreen/AlphaLISA技術など、さまざまな競合ベースのアッセイを使用することができます。^{[1,2,3 ]} これらの方法は、標的タンパク質またはリガーゼと、プローブに結合した結合パートナーとの相互作用を利用します。標的タンパク質と複合体化したとき、プローブは溶液中で遊離したときとは異なるシグナルを発します。

そこでPROTACを添加すると、プローブ結合パートナーが標的タンパク質から置換され、シグナルの検出が行われます。システムの協同性を判断するために、リガーゼ非存在下と存在下で、標的タンパク質のPROTACに対する親和性を比較することができます。しかし、これらの技術では、三元複合体形成の速度定数や三元複合体のt_1/2など、特定の重要な生物物理学的パラメータを測定することはできません。

ITCは熱力学的特性の測定やストイキオメトリの確認によく利用されます。しかし、ITCはスループットが低くタンパク質の必要量が多いです。また、結合速度論に関する情報は得られません。

1.4 Biacore™SPRシステムは、PROTACのさらなる生物物理学的特性評価を可能にします：

科学者たちはBiacore™ SPRシステムを生物物理学的なPROTACの特性評価に使用しています。これは現在、この分野で適用されているPROTAC三元複合体のkineticsを in vitro で測定できる唯一の技術です。この技術により、科学者は言及されたほぼすべての生物物理学的パラメータを迅速に決定することができます。Biacore™は以下の情報を提供します。

1.5 Case study – ブロモドメイン：MZ1：VCB三元複合体のカイネティクスプロファイリング

PROTAC MZ1は、VH032とJQ1の2つのバインダーをベースに、リンカーで接続されています。^[4] VH032はvon Hippel-Lindau (VHL) E3リガーゼに対する強力かつ特異的なリガンドであり、JQ1は汎用のブロモドメインおよびエクストラターミナル（BET）阻害剤です。^[5,6] JQ1はBETタンパク質Brd2、Brd3、Brd4のいずれのブロモドメイン（BD）に対しても大きな選択性を示さないが、MZ1はBrd3（ƛ = 4 × 10³ min^-13min^-1と14〜18 × 10³min^-1）を急速に減少させることが示されました。^[7]

このノートでは、SPRアッセイを使用して、PROTAC相互作用の詳細な機構的、速度論的特性を明らかにし、科学者がこの分野で広く適用できるようにすることを実証します。このアッセイはBiacore™ T200システムを用いて開発されましたが、Biacore™ X100、Biacore™ S200、Biacore™ 8Kシリーズなど他のBiacore™システムにも転用可能です。このアプリケーション例は、2019年にRoyらの発表した研究に基づき、本試験で使用されたアッセイの考察の概要を提供することを目的としています。

1.6 Biacore™アッセイのセットアップに関する注意事項

ターゲット：PROTAC：リガーゼの相互作用を完全に把握するためには、二元相互作用（ターゲット：PROTACまたはリガーゼ：PROTAC）および三元複合体の形成をモニターする必要があります。ターゲットまたはリガーゼのいずれかをセンサー表面にキャプチャーまたは共有結合させることができるが、いくつかの要因が固定化するタンパク質の選択に影響することがあります。^[8]例えば、単一のリガーゼを固定化することで、PROTACターゲットに関連する多くのタンパク質の組み合わせをスクリーニングし、単一のアッセイセットアップでターゲットの特異性を評価することができます。また、AviTag™のようなタンパク質ターゲット上のタグは、タンパク質のキャプチャーできるメリットがあります。

ビオチン化されたリガーゼやターゲットのキャプチャーには、アッセイ設計を容易にするため、また解離速度定数や半減期の遅い測定において安定した表面を保つために、Sensor Chip SAの使用を強く推奨します。あるタンパク質がセンサー表面に非特異的に結合し、アナライトとして使用できなくなった場合、このタンパク質をセンサー表面に固定化し、アッセイを逆転させることができます。この点で、科学者はアッセイの設定を、対象となる特定のタンパク質に合わせて調整することができます。

他の低分子SPR実験と同様に、ターゲットタンパク質とPROTACとのBiacore™結合実験をセットアップすることができます。^[9,10] しかし、三元系SPRの結合実験をデザインする際には、さらにいくつかの要因を考慮する必要があります：

材料と方法

1.7 Protein constructs

野生型および変異型BET BDであるBrd2^BD1、Brd2^BD2、Brd3^BD1、Brd3^BD2、Brd4^BD1およびBrd4^BD2、ならびにVCBと称するVHL-elongin B/C-Avi tag E3リガーゼ構築物は、Roy et al.2019によって記載されるように発現および精製されました。PROTAC MZ1はBoehringer Ingelheim opnMeポータルから提供されたものです。

1.8 リガンドの固定化

Series S Sensor Chip SAを、20 mM HEPES pH 7.0, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, 0.005 % TWEEN 20, 1 % DMSOを含むVHLランニングバッファで平衡化させた。Biacore™ T200 Control SoftwareのWizardを用いて、ビオチン化VCB（100 nM）を900 RUキャプチャーした（流速10 μL/min）。

1.9 三元複合体直接結合アッセイ

はじめに、PROTAC (10 mM in 100% DMSO) を、濃度2% DMSOのVHLランニングバッファー中で1 μMまたは200 nMに調製した。この溶液を、DMSOを含まないVHLランニングバッファーで希釈した50μM 標的ブロモドメインタンパク質の溶液と1：1で混合し、1％DMSOを含むVHLランニングバッファーで最終濃度 0.5μM PROTACおよび25μMブロモドメイン溶液（300μL）を調製した。この複合体を2μMのブロモドメインと1％DMSOを含むVHLランニングバッファーで連続希釈した（5点1/5 希釈シリーズ、PROTACの最終濃度500nM - 0.8nM, ブロモドメインの最終濃度25μM - 2μM）。ほぼすべてのPROTAC分子（95%-98%）が三元複合体結合実験を通してブロモドメイン結合状態を維持するように、実験を通して最低2μMの標的ブロモドメインタンパク質濃度が維持された。

三元系実験では、再生なしのsingle-cycle kinetic形式で低濃度から高濃度まで溶液を注入した（4回の繰り返し実験、コンタクト時間180秒、流量100μL/min、解離時間1000秒）、30秒のstabilization periodと注入の間のextra wash（50％DMSO）を使用した。blank subtractionに使用するため、すべてのシングルサイクル実験について、少なくとも2系列のブランク注入（2μMブロモドメインと1％DMSOを含むVHLランニングバッファー）を実施した。すべてのSPR測定は12℃で行いました。

1.10 データ分析

解析にはBiacore™ Insight Evaluation Softwareを使用しました。センサーグラムはリファレンスとブランクを差し引き、解析前に溶媒補正を行いました。結合速度（k_on）、解離速度（k_off）、解離定数（K_D）を計算するために、研究者はすべての二元（マルチサイクル）および三元（シングルサイクル）実験のデータに、質量mass-transportの項を含む1:1 binding modelを当てはめました。t_1/2 (ln(2)/k_off)はソフトウェアで自動的に計算されます。

結果

BETタンパク質BDの非存在下および存在下において、MZ1に対して二元および三元のSPR実験を行ったところ（Fig 2）、得られたK_D値は、以前にITCで得られたデータと一致した。^[7] このことは、Biacore™のシステムを用いて作成されたアフィニティデータがin-solution法と一致することを示しています。しかし、このアッセイはスループットに大きな利点を持ち、ITCでは不可能な三元複合体形成のキネティックキャラクタリゼーションが可能になります。

Fig 2. MZ1の2元対3元複合体直接結合アッセイのセットアップ例を示す模式図 まず、VHL-EloBC（VCB）をセンサーチップ上にキャプチャーする。左側はPROTAC単体の直接結合アッセイフォーマットで、代表的なMCKデータ（MZ1の1.6～1000 nMまでの濃度系列を反復試験したもの）。右はPROTACが標的タンパク質存在下でVHL-EloBCと結合する模式図で、Brd4^BD2存在下で0.8 nM - 500 nM MZ1のSCKセンサーグラムを代表的に示しています。

MZ1は、すべてのBETブロモドメインとの結合親和性が非常に高いにもかかわらず、Brd2やBrd3よりもBrd4を分解する。このことは、PROTACによる協同作用が関与している可能性を示唆している。そこで研究チームは、Fig 3に示すように、BETタンパク質Brd2、Brd3、Brd4ごとに、ブロモドメインBD1およびBD2の存在下と非存在下で、MZ1とVCBとの協同性と結合速度を比較する三元複合体Biacore™ assayを開発しました。

Fig 3. 異なるMZ1/BD複合体のSPRセンサーグラムでは、結合速度に著しい違いがあることがわかった。VCBをセンサー表面にキャプチャーし、SCKを用いてMZ1を0.8〜500nMまで注入します。1:1 binding modelをデータに当てはめ、キネティクス速度定数をTable 2に示しました。特にVHL/MZ1/Brd2^BD2とVHL/MZ1/Brd4^BD2の三元複合体は比較的ゆっくりと解離した（正のcooperativity αが高く、複合体がより安定した結果です）。

その結果、すべてのBD1ドメインの存在下で、MZ1はVCBから素早く解離し、低い正の協同性を示しました（α = 2.0 - 3.6）。 一方、三元複合体の結合実験では、すべてのBD2ドメインが解離速度が遅く（最大800倍）、高い協同性（α = 3.9 - 48）、高い複合体安定性を示すことが明らかになりました。特に、VCB/MZ1/BD複合体のt_1/2は、Brd3^BD2（t_1/2 = 40秒）に対してBrd2^BD2、Brd4^BD2（t_1/2 = 400秒、220秒）で著しく長くなっていることがわかりました。MZ1がBrd2^BD2およびBrd4^BD2とBrd3^BD2よりも長寿命の三元複合体を形成することと、MZ1によるBrd2^BD2およびBrd4^BD2の初期分解速度が速いことは、三元複合体の安定性がPROTAC活性の主要因ではないかという考えを裏付けるものでした。^[7]

RoyらはVCB/MZ1/Brd4^BD2とBrd3^BD2の3元複合体結晶構造を重ね合わせ、Brd3^BD2のZAループ内の1つのアミノ酸残基（Glu³⁴⁴、Brd2^BD2のGly³⁸²とBrd4^BD2のGly³⁸⁶に相当する）が、異なるブロモドメインに見られる協同性の差に関係していると思われることを発見しました。^[7] Glu³⁴⁴の置換は、複合体のVHL/MZ1部分と激しい立体衝突を引き起こし、不安定化をもたらすと示唆されました。

そこで、先に述べたBiacore™アッセイを用いて、GtoEおよびEtoGの標的変異を持つBrd4^BD2およびBrd3^BD2（Brd4^BD2,G386EおよびBrd3^BD2,E344G）の三元複合体のkineticsを測定した（Fig 4）。

Fig 4. 三元複合体の形成は、1つのアミノ酸置換に影響される。 VCB/MZ1/Brd4^BD2三者複合体の結晶構造（PDB: 5T35）から、同等のclose-packing相互作用を採用したVHL/MZ1/Brd3^BD2三者複合体は、ブロモドメインのZAループ内の1アミノ酸（Brd3^BD2のGlu344、Brd4^BD2のGly386と対応）のVHL/MZ1と立体的衝突により安定性が低い可能性があると示唆された。 Brd3^BD2（a）またはBrd4^BD2（b）のこの1つのGly/Glu残基を相互に交換すると、結果としてVHL/MZ1/BD三元複合体のSPRセンサーグラムの速度論的プロファイルが対応するように入れ替わりました。KineticのパラメーターをTable 2に示します。

その結果、Brd4^BD2のG-to-E変異は三元複合体のt_1/2を短くし、協力性と複合体の安定性を低下させることが明らかとなりました。しかし、Brd3^BD2の復帰変異は三元複合体のt_1/2を拡張し、Brd4^BD2のkineticsプロファイルにより近いものにしました。 また、競合的蛍光偏光アッセイを用いたクロスバリデーションにより、K_DとK_I値および協同性との良好な相関が確認されました。

Table 2. Kinetic三元複合体形成研究のパラメータ

Bromodomain	ka(×106 M-1s-1)	kd (×10-2 s-1)	KD(nM)	t1/2 (s)
BRD2-BD1	5.0 (± 0.07)	7.1 (± 0.01)	14	9.7
BRD3-BD1	1.6 (± 0.004)	2.6 (± 0.006)	17	27
BRD4-BD1	2.8 (± 0.03)	2.6 (± 0.02)	9.2	27
BRD2-BD2	2.5 (± 0.01)	0.17 (± 0.0004)	0.69	410
BRD3-BD2	2.0 (± 0.01)	1.7 (± 0.007)	8.5	41
BRD4-BD2	1.4 (± 0.002)	0.32 (± 0.0003)	2.2	220
BRD3-2_E344G	1.6 (± 0.002)	0.20 (± 0.0001))	1.3	340
BRD4-2_G386E	1.3 (± 0.01)	1.2 (± 0.004)	9.4	56

 

アナライトのサイズは、三元SPR結合実験（PROTAC＋タンパク質）では、二元SPR結合実験（PROTAC単独）よりもはるかに大きくなります。今回発表されたデータは、二元系実験と比較してR_maxが高いことから、三元複合体の形成が肯定的に確認されました（Fig 2）。二元および三元複合体のデータは、同じタンパク質固定化を用いて測定することができるが、mass transport limitationを克服し、高密度表面で問題となりうる他の実験アーティファクトを減らすために、三元複合体実験用に別の低密度表面を使用することが推奨されます。

Discussion

標的タンパク質：PROTAC：リガーゼ三元複合体形成のKineticsを特徴付けるためのシンプルで堅牢な方法を説明します。センサー表面にE3リガーゼを取り付けることで、ターゲットタンパク質を問わず、複数のPROTAC:targetの組み合わせを迅速に測定することが可能になります。理論的には、このアッセイフォーマットはあらゆるPROTAC:targetシステムに適用でき、Biacore™ X100などの他のSPRシステムへ直接移行することが可能です。しかし、ターゲットタンパク質が不足している場合や、タグ付きタンパク質を細胞溶解液から直接キャプチャーし、アッセイ開発を最小限に抑えたい場合には、このフォーマットを逆にすることも可能です。本研究で得られたK_D値は、ITCやFPアッセイによる間接的なK_I測定などの手法でオルソゴナルに得られた値とよく比較されます。このBiacore™のアッセイは、他の直接結合アッセイと比較して、より高いスループットで速度定数やt_1/2を決定することができるのが特徴です。このデータから、たった一つのアミノ酸置換が三元複合体形成の速度論、協同性、t_1/2に大きな影響を与えることが明らかとなりました。このデータは、従来の低分子阻害剤の創薬において薬物-標的のresidence timeを理解するのと同様に、効率的な標的分解を予測するために、三元複合体の寿命を理解することの重要性をも示しています。

この研究の明確な将来の進展は、PROTAC創薬プロセスのより早い段階でこのアッセイを取り入れることであります。PROTACのヒット化合物の同定と最適化の段階で、K_D、t_1/2とcooperativityを早期に理解することにより、3つの複合体の望ましい安定化を誘導するものを選択でき、より効率の良い標的分解、ひいてはより有効な薬剤につながる可能性があります。後期プロジェクトでは、三元複合体が非常に高いt_1/2を示すことがあります。したがって、Biacore™ 8KやBiacore™ 8K+システムのようなマルチニードル装置で、いくつかのsingle-cycle Kinetics実験を並行して行うことができるオプションがあると便利でしょう。 PROTACに加えて、lysosome target chimeras（LYTACS）やバイスペシフィック抗体など、他のヘテロな二価分子によって引き起こされる三者間結合平衡の特性評価にも、この試験形式を採用することができます。

Cytivaは、この記事の掲載にあたり、データを提供してくださったProfessor Alessio Ciulli と Dr David Zollman, University of Dundeeに感謝します。

References