第2章
サンプルの採取、安定化およびタンパク質抽出（2）

タンパク質の安定化

タンパク質の寿命には幅があり、ホルモンのように数秒のものからコラーゲンのように数年まであるものもあります。寿命にはタンパク質の電荷と二次構造が深く関与します。また、共存するプロテアーゼおよび他のタンパク質修飾酵素の酵素活性のほか、調製時に誘発される有害な化学反応、変性などの立体構造の変化も関与しています。調製の過程で生じる修飾については、表2.2を参照してください。安定性への影響には可逆性のものと不可逆性のものがあります。以下で、一般的に生じる修飾をいくつか取り上げて詳述します。

表2.2　有害な化学反応とin vitroにおけるタンパク質安定性への影響

共有結合の修飾
修飾	コメント
加水分解	酵素によるタンパク質分解など
酸化	特に、メチオニン残基、トリプトファン残基、ヒスチジン残基
脱アミド	アスパラギン残基、一部のグルタミン残基
β脱離	アスパラギン酸残基
イソペプチド結合	リジン残基側鎖とグルタミン酸/アスパラギン酸残基側鎖とのアミド結合
ラセミ化反応	アミノ酸のL型からD型への変換、変換速度は遅い
S-S交換反応あるいはチオール/S-S交換反応	システイン架橋
メイラード反応	アミノ酸と還元糖とのアミン反応
立体構造の変化（変性、アンフォールディング、凝集）
変化	コメント
プロトン化、脱プロトン化	極端なpH
疎水性中心の溶媒和	界面活性剤など
タンパク質の疎水性コア（ポケット）への水分子の侵入による変性	圧力など
ずり応力	撹拌、流れ、UFなど
非極性ポケットへのへの水分子の侵入による変性	高温など
分子内塩架橋による反発や吸引	二価の金属イオン
転移	塩溶

極めて安定なタンパク質を除き、通常は採取後のサンプルを迅速に安定化する必要があります。抽出前は各細胞区画に空間的に分離され存在していたタンパク質サンプルが、凍結/解凍およびホモジナイゼーションを経て、全タンパク質が1つの空間に無秩序に存在することになり、修飾酵素と接触しやすくなるためです。安定化は、すべての酵素活性を低下させ修飾を最小限に抑えるという単純なものです。しかし、実際には極めて困難です。まず安定化以降の実験でタンパク質の立体構造を保持する必要があるかどうか判断します。急激な加熱などでサンプル中のすべてのタンパク質を変性させれば酵素活性の速やかな停止が可能ですが、後からタンパク質の活性を本来の状態に戻せないことがあります。非変性タンパク質が必要な場合には、有害な酵素活性を阻害する化学物質と組み合わせた穏和な抽出法を使用します。

加水分解からの保護

アミノ酸を分析する場合など、タンパク質のペプチド結合を非酵素的に加水分解するためには、塩酸などの強酸の存在下でサンプルを長時間加熱します。サンプル調製中にも非酵素的ペプチド加水分解が生じることがあり、pH 2以下でアスパラギン酸・プロリン結合の分解が促進されます (2)。これを除き、タンパク質中のペプチドの加水分解の主な原因はプロテアーゼ（ペプチダーゼまたはペプチドヒドロラーゼとも呼ばれます）の作用です。プロテアーゼはすべての細胞小器官中で自然に生じます。国際生化学分子生物学連合（IUBMB）が認めているサブクラスとして、エキソペプチダーゼとエンドペプチダーゼの2つがあります。エキソペプチダーゼは、ポリペプチド鎖の末端近くでのみ作用し、触媒機構に基づいてサブ-サブクラスに分類されます。以下にプロテアーゼの例を挙げます。

エキソペプチダーゼ

• アミノペプチダーゼ（例：アラニンアミノペプチダーゼ）
• ジペプチジルペプチダーゼ（例：カテプシンC）

エンドペプチダーゼ

• セリンプロテアーゼ（例：キモトリプシン）
• システインプロテアーゼ（例：パパイン）
• アスパラギン酸プロテアーゼ（例：ペニシロペプシン）
• メタロエンドペプチダーゼ（例：サーモリシン）

プロテアーゼの触媒型ごとに特徴的な阻害剤があります。そのいくつかの例を表2.3に示します。詳細は参考文献3、4、5を参照してください。

加水分解に関与するもう1つの重要な反応は、セリン、スレオニンおよびチロシン残基の可逆的リン酸化です。リン酸化と脱リン酸化は、それぞれプロテインキナーゼとホスファターゼの相対する作用によって厳密に制御されます。ホスファターゼは、リン酸化されたタンパク質およびペプチドを検出する目的でサンプルを調製する場合に特に問題となります。ホスファターゼにはセリン/スレオニンホスファターゼとチロシンホスファターゼという2つのスーパーファミリーがあり、化学的に阻害できます。阻害には数種類の化合物の混合物を使用するのが効果的とされ、バナジン酸、モリブデン酸、酒石酸、イミダゾール、オカダ酸などの塩は、さまざまなクラスのホスファターゼを阻害します。

表2.3　プロテアーゼとホスファターゼに対する阻害剤の例

プロテアーゼ阻害剤2
阻害剤	至適濃度	ターゲット	コメント
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)3	0.5-1 mM	セリンプロテアーゼ、一部のシステインプロテアーゼ	PMSFは、セリンプロテアーゼと一部のシステインプロテアーゼを不活化する不可逆的阻害剤です。PMSFは水溶液中で速やかに不活性化されます。使用直前に調製します。チオール試薬が存在すると有効性が低下します。PMSFはきわめて毒性が高い物質です。
Aminoethyl benzylsulfonyl fluoride (AEBSF)	up to 4 mM	セリンプロテアーゼ	PMSFに比べ溶解性が高く毒性が低い阻害剤です。この物質が誘発する修飾によりタンパク質のpIが変化することがあり、二次元PAGEおよびMS分析に影響する可能性があります。
4-Aminophenyl- methylsulfonyl fluoride (APMSF)	0.4-4 mM	セリンプロテアーゼ
EDTA	2-10 mM	Zn、Feなどの金属依存性プロテアーゼ	粘性の高いサンプル中の核酸を分解するために添加したヌクレアーゼを、Mg2+と結合することで阻害します。
EGTA	2-10 mM	カルシウムなどの金属依存性プロテアーゼ	Mg2+と結合しないため、ヌクレアーゼを阻害しません。
Pepstatin	1 µM	アスパラギン酸プロテアーゼ	タンパク質分析に干渉することがあります。
Leupeptin	10-100 µM	システイン、セリンプロテアーゼ	タンパク質分析に干渉することがあります。
Chymostatin	10-100 µM	キモトリプシン、パパイン、システイン、プロテアーゼ	タンパク質分析に干渉することがあります。
Antipain-HCl	1-100 µM	パパイン、システインおよびセリンプロテアーゼ
Tosyl lysine chloromethyl ketone (TLCK), tosyl phenylalanine chloromethyl ketone(TPCK)	0.1-0.5 mM	システインおよびセリンプロテアーゼ	不可逆的阻害剤です。
Benzamidine-HCl	0.2 mM	セリンプロテアーゼ
ホスファターゼ阻害剤
阻害剤	至適濃度	ターゲット	コメント
オルトバナジン酸ナトリウム	0.4-0.5 mM	チロシン、プロテイン、ホスファターゼ（PTRs）	競合的阻害剤です。バナジン酸による阻害は、EDTA添加または希釈により、可逆的に消失します。
カリクリン A	50-100 nM	セリン、スレオニンプロテアーゼ

1 文献の6、7をご参照ください。
2 プロテアーゼインヒビターは各社から混合した状態で販売されています。弊社製品へのリンクはこちら。
3 PSMFは毒性の高い試薬です。水溶液での半減期は35分です。PMSF通常10～100 ｍMの濃度のストック溶液をイソプロパノールで作成し、-20℃で保存します。

Protease Inhibitor Mixを用いたプロテアーゼ阻害

セリン、システインおよびカルパインプロテアーゼに対する競合的および非競合的プロテアーゼ阻害剤を組み合わせたProtease Inhibitor Mixをご提供しています。Protease Inhibitor Mixはプロテアーゼ活性を効率的に95%以上阻害し、動物組織、植物組織、酵母および細菌からのサンプル調製中にタンパク質を酵素による分解から保護します。この阻害剤カクテルは二次元電気泳動の研究に使用するサンプルを調製できるように特別に開発されたものですが、その他広い実験で使用できます。オプションとしてEDTAを添加してメタロプロテアーゼを阻害できます。ただし、EDTAが存在しなければサンプルから核酸を除去するヌクレアーゼが活性化されることに留意してください。そのため、タンパク質サンプルにヌクレアーゼを添加する場合には、EDTAではなく、EGTAを使用します。EGTAならば、ヌクレアーゼ活性に必要なMg2+とキレートを形成しないためです。

材料

前調製

プロトコール

1その他さまざまな抽出バッファーを提供しています。二次元電気泳動用、酵母からの可溶性タンパク質用、ほ乳類培養細胞からの可溶性タンパク質用など。

オプション

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