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Location:Home > 実験手法別製品・技術情報 > タンパク質サンプル調製・前処理 |
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第2章
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2-D Protein Extraction Buffer | Composition |
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2-D Protein Extraction Buffer-I with DILUENT-I, 50 ml | Urea (< 10 M) and NP-40 (< 10%) |
2-D Protein Extraction Buffer-II with DILUENT-II, 50 ml | Urea (< 10 M) and CHAPS (< 10%) |
2-D Protein Extraction Buffer-III with DILUENT-III, 50 ml | Urea (< 8 M), Thiourea (< 5 M), CHAPS (< 5%), and Amidosulfobetaine-16 (ASB-16) (< 5%) |
2-D Protein Extraction Buffer-IV with DILUENT-III, 50 ml | Urea (< 8 M), Thiourea (< 5 M), CHAPS (< 5%), and n-Decyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1- propanesulfonate (SB 3-10) (< 5%) |
2-D Protein Extraction Buffer-V with DILUENT-II, 50 ml | Urea (< 8 M), Thiourea (< 5 M), and CHAPS (< 10%) |
2-D Protein Extraction Buffer-VI with DILUENT-III, 50 ml | Urea (< 8 M), Thiourea (< 5 M), CHAPS (< 5%), and3-(1-Pyridino)-1-propane sulfonate (NDSB-201) (< 4%) |
2-D Protein Extraction Buffer Trial Kit, 6 × 10 ml | 2-D Protein Extraction Buffer-I, -II, -III, -IV, -V and –VI, including DILUENT-I to -III |
これらのバッファーは乾燥粉末ですので、カルバミル化に関連する問題が生じません。使用するサンプルおよび分析手法によっては、酵素阻害剤や還元剤などの添加剤を添加できます(上記の一般的な考慮事項を参照してください)。これらのバッファーは二次元電気泳動に適合しますが、一次元電気泳動など他の分析手法にも使用できる場合があります。2-D Protein Extraction Bufferは、2D DIGE(蛍光標識二次元発現差異解析)の蛍光標識に適合しますが、以下のような例外があります。
Extraction Buffer-IおよびIIは大半の分析手法に適しています。しかし、さらに強い可溶化作用が必要な場合には、Extraction Buffer-III、IV、VまたはVIを使用します。
二次元電気泳動ワークフローの例を下の図2.5に示します。
図2.5 2D DIGEを使用して2-D Protein Extraction Buffer-I~VIの抽出能力の差を評価するためのワークフロー
以下の例(図2.6)では、6種類の抽出バッファーのラット肝タンパク質抽出能力を標準バッファーと比較しました。抽出バッファーの大半がminimal dyeに適合し、標準バッファーと比べて高い標識強度を示していますが、Extraction Buffer (EB)-Iは標識効率が低く、CyDye™ minimal dyeを使用する場合にはこのバッファーは適していません。
図2.6 ラット肝サンプルを標準バッファーまたは2-D Protein Extraction Buffer-I~VIを使用して抽出しました。その後、タンパク質抽出液をCyDye™ minimal dyeで標識し、ExcelGel™ 8-18を用いて泳動しました。3レーンを1組として、各レーンに20、10または5 μlのサンプルをアプライしました。
2-D Protein Extraction Buffer Trial Kitに付属の2-D Protein Extraction Buffer-I~VI(乾燥粉末)と希釈用液I~III
酵素阻害剤(例:Protease Inhibitor Mix)
バッファー添加剤および他の添加剤(前述の考慮事項を参照してください)
還元剤
キットに付属の2-D Protein Extraction Buffer-I~VIに規定の希釈用液を5.75 mlまたは5.0 mlを加えて溶解します。規定の希釈用液(使用説明書に従ってください)を対応する2-D Protein Extraction Bufferのボトルに直接添加します。
乾燥粉末ミックス1 gに規定の希釈用液(使用説明書を参照してください)を1 mlまたは1.15 ml添加することで、少量のバッファーを調製することもできます。
還元剤、阻害剤、両性担体(キャリアアンフォライト)、ブロモフェノールブルー染料などの必要な添加剤を加えます。
一定間隔でボルテックスしながら混合し、溶液が透明になるまで室温でインキュベートします。分析手法によってはDTTおよびEDTAを添加します。使用に適した量の2-D Protein Extraction Bufferを、一定の最終濃度(例えば5 mM)に達するようにDTTおよびEDTAを添加して調製します。
プロテアーゼ活性の阻害が必要な場合には、プロテアーゼ阻害剤のカクテルを添加して抽出時のプロテアーゼ活性を抑えます(Protease Inhibitor Mixの項を参照してください)。
細胞破壊または組織ホモジナイズを行うときに、瞬間凍結させたサンプルをトリクロロ酢酸(TCA)存在下で破砕するなどの方法で、タンパク質を沈殿させて不溶化すると有用な場合があります。主な非タンパク質夾雑物(例:核酸、脂質、炭水化物など)は溶解したままなので簡単に除去できます。ろ過または遠心分離で沈殿物を回収し、タンパク質を適切なバッファーに再溶解できます。沈殿法については、第3章のサンプル中の夾雑物除去との関連で詳しく説明します。
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