2019年、中国・武漢で発生した肺炎の原因として、新型コロナウイルス（SARS CoV-2）が確認されました。COVID-19と呼ばれるこの病気の非常に急速な広がりは、世界中の医療システム、診断ラボ、基礎研究コミュニティーに数多くの緊急の課題を引き起こしました。

再現性のある迅速な病原体の核酸抽出に対する需要はかつてないほど高く、その結果、世界中の診断ラボや研究機関にとって制限的な要因となっています。

Sera-Xtracta™ Virus/Pathogen Kit は、低濃度のウイルスやその他の病原体を高感度に検出するためのワークフローを最適化する、シンプルで迅速な方法を提供します。このキットは、シリカコーティングされた磁気ビーズをベースにした自動化キットで、呼吸器系の生物学的マトリクス、血液、ユニバーサルトランスポートメディア（UTM、検体輸送用培地）など、さまざまな種類のサンプルに使用できます。本キットは、ノンキャリアRNAベースのケミストリーを用いて、以下のようなバクテリアやウイルスの全核酸をハイスループットで選択的に結合するように設計されています。アデノウイルス（14型）、インフルエンザA（H3N2）、SARS-CoV-2（COVID-19）などのウイルスやバクテリアの全核酸をハイスループットで選択的に結合することができます。図1aおよび図1bに示した分離手順は、60分以内に完了することができ、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（RT-qPCR）、ドロップレットデジタルPCR（ddPCR）、次世代シーケンシング（NGS）などの分子生物学技術と互換性のある再現性のある収量を得ることができます。

Whatman™ 903 Proteinsaverカードなどのろ紙は、米国では新生児の代謝異常や遺伝性疾患の診断スクリーニングにおける血液検体の採取、保存、検査に長年使用されてきました。最近では、低コスト、低侵襲、輸送・回収・保管の簡便さ、バイオハザードリスクの低減などの特性から、Roche Amplicor™ HIV-1 DNA PCR検査による乳児早期診断（米国大統領エイズ救済緊急計画（President's Emergency Plan for AIDS Relief (PEPFA)）による支援）、リアルタイムPCRによるHIV-1診断・ウイルス量測定、HIV-1薬剤耐性ジェノタイピングなど、HIV関連の分子アッセイに多くの国で使用されています(1)。その理由として、低コスト、低侵襲、輸送・回収・保管の簡便さ、バイオハザードリスクの低減などが挙げられます(2)。

COVID-19の疑いのある症例では、通常、綿棒でサンプルを採取し、検査前に安定化と輸送のためにUTMに保存します。場合によっては、唾液を採取することもあります(3)。UTMや生体液をWhatman™ 903カードに採取・保存する主な利点は、一度完全に乾燥させれば、サンプルは非感染性・非危険性とみなされ(4, 5)、保存のためのコールドチェーン・ストレージを必要とせず、安全に輸送することができ、特殊な輸送条件の必要性を最小限に抑えることができることです(表1)。さらに、最近の研究では、ボール紙上では24時間後に生存するSARS-CoV-2は測定されませんでした(6)。これは、紙のような他の多孔質材料の良い指標であり、903カードがCOVID-19サンプルの安全な輸送方法となり得ることを示しています。

以下のデータは、Whatman™ 903カードに採取したUTMおよび生体液からのウイルスRNAの抽出にSera-Xtracta™ Virus/Pathogen Kitを使用する場合の概念実証を示しています。

Workflow for initial lysis and homogenisation of Whatman™ 903 cards

図1a Whatman™ 903カードの初期溶解とホモジナイゼーションのワークフロー

Nucleic acid isolation process in green

図1b Sera-Xtracta™ Virus/Pathogenキットを使用したワークフロー

実験条件

Sera-Xtracta™ Virus/Pathogen Kit（製品コード29506009）を用いて，Whatman™ 903カードに採取したUTMおよび血液からSARS-CoV-2（COVID-19）のRNAを抽出する実験を行いました。この実験は診断ラボで日常的に行われているヒトのスワブサンプルや生体液（血液や唾液など）からのウイルス検出に大きく関連するものです。

この実験では、熱で不活性化したSARS-CoV-2ウイルス粒子（American Type Culture Collection, ATCC）をヒト細胞（～3×10^5/mL）を含むユニバーサル・トランスポート・メディア（COPAN Diagnostics Inc）に50コピー/µLでスパイクして、臨床スワブ・サンプルを模倣しました。さらに、ヒトの生体液からのCOVID-19 RNAの保存と抽出を調べるために、ヒトの全血にウイルス粒子をスパイクしました。スパイクした血液およびスパイクしたUTM/細胞サンプルの20 µLをWhatman™ 903カードにスポットし、室温で3時間乾燥させた後、Whatman™ foil barrier zip sealing bag（製品コード10534321）に保存しました。スパイクされていない細胞懸濁液および全血（ウイルスRNAを含まない）の20 µLをWhatman™ 903カードにスポットし、偽陽性の可能性を排除するためにアッセイコントロールとして使用しました。

ウイルスRNAは，スポットしたWhatman™ 903カードから，室温で一晩（T0）および14日間（T14）保存した後に抽出しました。各カードから直径12 mmのパンチ（20 µLの乾燥サンプル全体を取り出すのに十分な大きさ）を取り出し、最初の溶解工程（「方法」の項を参照）を経た後、Sera-Xtracta™ Virus/Pathogen kitを用いてメーカーの説明書に従って処理を行いました。

サンプルを50 µLのヌクレアーゼフリーの水に溶かし、Centes for Disease Control and Prevention (CDC)のガイドライン(7)に従ってReal-Time RT-PCRアッセイを行いました。TaqPath™1-Step RT-qPCR Master Mix, CG（ThermoFisher Scientific社製）およびCDC 2019 Novel Coronavirus（2019-nCoV）Diagnostic Panelプライマー（N1：COVID-19ヌクレオカプシド遺伝子の領域を標的とし、RNase P：ヒトRNase P遺伝子を標的とするIDT社製）を用いて、抽出したサンプル（1ウェルあたり5 µLの溶出液）を技術的に重複して実施しました。

CDCのガイドラインに従い、N1マーカーがCt＜40の閾値を超えたサンプルのみを陽性としました。スパイクされていないコントロールでは、N1、COVID-19に特異的なプライマーセットでの増幅は観察されませんでした（データ未記載）。

方法

試薬は、Sera-Xtracta™ Virus/Pathogen kitのユーザーマニュアルに記載されている通りに調製しました。

Whatman™ 903 カードからの溶解とホモジナイズ - Whatman™ 903 カードからウイルス RNA を抽出する場合、Sera-Xtracta™ Virus/Pathogen Kit を使用する前に以下の手順を実行する必要があります。

  • Whatman™ 903カードから直径約12mmのパンチ（20µLの乾燥試料を取り出すのに十分な大きさ）を取り出し、滅菌したヌクレアーゼフリーの1.5mLエッペンドルフ™チューブに入れる。
  • 各チューブに10 μL Proteinase K（@ 20 mg/mL、Sera-Xtracta™ Virus/Pathogen Kitに付属）および500 μL lysis buffer（7 M Guanidine Hydrochoride, 50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 5% w/v TWEEN-20, 4% w/v Triton X-100, pH 7.0に調整）を加える。
  • サーモミキサーを用いて、37℃で1時間、450rpmで振とうする。
  • インキュベート後、滅菌した1mLのピペットチップを用いて、パンチを潰してパルプ状のスラリーを得る。
  • 12,000×gで4分間遠心分離する。
  • ピペットチップを使って、パンチからチューブの側面（上澄み液の上）にパルプ状スラリーを移動させ、1mLのピペットチップでパンチ/パルプ状スラリーをチューブの側面に押し付けて液体を絞り出す。
  • チューブを約5分間放置し、パンチから上澄み液が滴下するのを待つ。
  • 上澄み液を新しい滅菌済みエッペンドルフチューブに移し、Sera-Xtracta™ Virus/Pathogen Kit のユーザーマニュアル（製品コード 29506009）に記載されている通りに、最大 400 µL の 903 抽出液を処理する。

結果と考察

インプットサンプルに含まれる50コピー/µLのSARS-CoV-2 RNAの検出

図2および図3に示した結果から、Whatman™ 903カードとSera-Xtracta™ Virus/Pathogen Kitにおいて、ヒト全血およびヒト細胞を含むUTM中の50コピー/µL以下のウイルスRNAは、Whatman™ 903カードにスポット後に室温で14日間保存しても、信頼性の高いサンプル保存および核酸精製（NAP™）能を提供することが確認されました。T0（24時間）およびT14（14日）のCt値は、液体コントロールと同等であり（p＞0.05、不対t検定。注：不確定なCt値はt-testに含まれない）、COVID-19ウイルスRNAをWhatman™ 903カードに保存しても収量が低下しないことが示されました。

Whatman™ 903カードは、ウイルスRNAやCOVID-19サンプルの収集、保管、輸送に有効なオプションです。Whatman™ 903カードでのCOVID-19 RNAの14日間の安定性は、検査のため実験室へ輸送するのに十分な時間を提供します。HIVウイルスRNAの保存を成功させるために、WHOは乾燥血液スポット（Whatman™ 903などの紙製カードに血液を採取し、その後乾燥血液スポット（DBS）を診断目的で使用すること）を採取後14日まで常温で保存および/または輸送できることを推奨しています。この期間を過ぎると、DBSは遺伝子型判定のために処理されるか、-20℃以下で冷凍保存する必要があります(8)。Whatman™ 903カードに保存されたウイルスRNA（HIV）の長期保存条件を検討した論文の一覧とその主な結果は表1をご覧ください。

図2

Detection of heat inactivated SARS-CoV-2 diluted in COPAN UTM containing human cells

図3

Detection of heat inactivated SARS-CoV-2 diluted in whole human blood containing human cells

図2および図3. ヒト細胞を含むUTM（図2）およびヒト全血（図3）にスパイクされたウイルスRNAについて得られたCt値で、Whatman™ 903カードに室温で24時間（T0）および14日間（T14）保存したもの。Ct値は、N1 COVID-19 特異的プライマーにより増幅したウイルスRNA（熱で不活化した50コピー/µL）とヒト特異的RNase Pプライマーによって算出されています。N1 COVID-19特異的プライマーセットの値は、T0での2回の技術的複製とT14での3回の技術的複製（各独立した抽出について）の平均値です。エラーバーは標準偏差を表しています。なお、COVID-19特異的増幅は、スパイクされていないコントロールサンプルのいずれにおいても検出されませんでした（Ct未決定）。（データ未掲載）

表1. HIVウイルスRNAジェノタイピング用の乾燥血液スポット（DBS）をスポットしたWhatman™ 903カードの最適な保存条件を調査した発表論文の概要（WHO Manual for HIV Drug Resistance Testing Using Dried Blood Spot Specimens (8)より引用）。

Storage conditions tested
Study Time Temperature/Humidity Desiccant Outcomes
Garcia-Lerma 9 1–16 weeks 37°C / high humidity, -20°C Yes DBS stable at 37°C only for 1-2 weeks. -20°C recommended for long-term storage. -20°C superior for short and long term.
Buckton 10 3 months -20°C, 4°C, 20°C Yes HIV DNA PCR only. No observed degradation in HIV DNA during 3 month study period.
Bertagnolio 11 3 months 37°C / 85% humidity Yes Good amplification rate (90%)
McNulty 12 6 years
5 years
2–3 years 		-30°C
Ambient temperature and -70°C
-20°C 		Yes Complete degradation at ambient temperature, stable at -30°C and -70°C; -20°C recommended for long-term storage.
Nelson 13 3–6 years Ambient temperature Yes Moderately successful amplification rate (69%); 1 log drop in viral load.
Wallis 14 3 months Ambient temperature, 4°C, -20°C Yes Some reduction in amplification rate at ambient temp. vs. 4°C or -20°C.

結論

Sera-Xtracta™ Virus/Pathogen キットは、様々な種類のサンプルや異なる濃度のサンプルから効率的に全核酸（DNA/RNA）を回収し、ダウンストリームで高感度に検出することができます。このキットは、低濃度のウイルスやその他の病原体を高感度で検出するために、ワークフローを最適化したいと考えている分子診断検査室に、簡単で迅速な方法を提供します。本キットは、自動化に対応しており、磁気ビーズを使用しているため、装置の柔軟性にも優れています。

本キットは、COVID-19の世界的な流行に対応するために開発されたもので、検査や科学研究用のキットを供給する際に直面する課題を解決することを目的としています。本キットのフォーマットと迅速なプロトコルは、ウイルスの検出と研究に向けた科学・医学界の世界的な取り組みを支援する優れたハイスループットソリューションを提供します。

また、Sera Xtracta Virus/Pathogen キットは、Whatman™ 903 カードからの病原体の核酸抽出を再現性よく行うことができます。Whatman™ 903カードにUTMや生体液を採取・保存する利点は、一度完全に乾燥させれば、サンプルは非感染性・非危険性とみなされ(4, 5)、保存のためのコールドチェーン・ストレージを必要とせず、安全に輸送することができ、特別な輸送条件の必要性を最小限に抑えることができることです。本研究では、Whatman™ 903カードが、ウイルスRNAおよびCOVID-19サンプルの収集、保管、輸送のための実行可能なオプションであることを実証しました。Whatman™ 903カードに保存されたウイルスRNAは、室温で14日間安定していたため、検査室に輸送して検査するのに十分な時間がありました。

なお、Sera-Xtracta™ Virus/Pathogenキットは、研究目的でのみ使用可能です。

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Detection and genotyping of Viral RNA