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ウェスタンブロッティングでリン酸化シグナル検出が難しい3つの原因と解決法

リン酸化は翻訳後修飾の中でも重要性が高く、シグナル伝達、アポトーシス、細胞周期、増殖など様々な細胞プロセスにおいて、詳細に研究されています。

リン酸化タンパク質をウェスタンブロッティングで検出するには、実験のステップでホスファターゼ阻害剤の添加やブロッキングバッファーの選択など、一般的な注意点はいくつかありますが、最も検出や解析を困難にさせている要因に下記3つが挙げられます。

原因その1. リン酸化体/非リン酸化体のバンドの近接

近接しているため、ノイズが高い場合に、シングルバンドとして検出されてしまう。

原因その2. リン酸化特異的抗体の低感度性

Loading量や抗体濃度といった多くの検討が必要になる上、低感度のままだとノイズに埋もれてしまう。

原因その3. リン酸化体/非リン酸化体の割合に偏りがある

濃く検出されるバンドが、薄いバンドにオーバーラップして、シングルバンドとして検出されてしまう。

原因その1に関しては、別途アプリケーションノートにある Phos-tag で解決できる部分もありますが、原因その2や原因その3が複合的要因になり解析を困難にする場合もあります。

ImageQuant 800の新しい検出モード”SNOW (Signal Noise Optimization Watch) mode” (US20210033537A1)は加算平均の原理を用いてノイズを低減し、濃いバンドを飽和させず薄いバンドを検出する事ができるため、リン酸化タンパク質の検出への可能性を秘めています。

バンドのノイズ低減_ImageQuant800 SNOWモード

関連ウェビナー

ウェスタンブロッティングによるリン酸化解析の新しい可能性, SNOW mode


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