タンパク質の精製戦略

精製手法、レジンの選択方法

生体物質には核酸、タンパク質、脂質等々さまざまな方法がありますが、ここではタンパク質にフォーカスして、その精製戦略の立て方をご紹介いたします。後工程で必要となる収量と純度を考慮しつつ、3段階に分けて考えると精製戦略が立てやすくなります（表1）。

スタートとなる原料はサンプル液量が多く、さまざまなタンパク質が混在し、さらにタンパク質を分解するプロテアーゼも含まれます。そのため目的タンパク質にとって危険な環境と言えます。目的タンパク質を、一刻も早く安全な状態にするのが初期精製の優先事項となります。このステップに必要な要素は大きな処理量と短時間で精製できることで、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーが主に用いられます。

中間精製ではさらに混在する不純物を取り除きます。分離能を上げるのも重要ですが、キャパシティーや回収率も重要です。このステップはアフィニティー、イオン交換、疎水性相互作用、ゲルろ過などのクロマトグラフィー手法が使用されます。

最終精製では、目的タンパク質自身が重合・変性したものや、修飾が取れたものなど、性質が似通っており、初期、中間で選択した手法では分けられなかった物質を分離します。ここでは分離能が高いことが要求され、手法としてはゲルろ過クロマトグラフィーやイオン交換クロマトグラフィーなどが使われます。

このように、クロマトグラフィーの手法の特性（表2）を考慮しつつ精製します。毎回、3ステップが必ず必要になるわけではありません。 目的によっては、4種以上のクロマトグラフィーが必要なこともありますし、目的タンパク質の収量と純度を達成できるならば1種類のクロマトグラフィーで済むこともあります。できるだけ前処理やバッファー交換の必要がないようにステップを組み合せるのがベストです。

表1　精製段階とその課題

表2　クロマトグラフィーの手法の特性

各精製ステップの目的にあったレジンを選択することも重要です。特にレジンの性質の中でも粒子径にフォーカスしてご紹介したいと思います。図1の通り、大きい粒子サイズのほうが低圧で早く送液することができます。一方で、分離ピークは広がったようになります。粒子が小さいサイズの場合は、高い圧をかけてゆっくり流すことで、分離能は高くなり、シャープなピークとなります。また、一般的に小さい粒子径のレジンのほうが、高価な傾向にあります。

これを各ステップの目的や要件にあわせると、表3のようになり、初期精製では大きい粒子のレジンを、最終精製では小さい粒 子のレジンを選ぶようにします。

表3　精製段階とレジン粒子径の適合