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Introduction

mAb製造のための新しいフェッドバッチプロセスの開発と最適化は、複雑である必要はありません。培養時間中に細胞株が必要とする栄養素、代謝物の影響、臨界浸透圧など、細胞株に関するいくつかの重要な事項を最初から把握しておくことで、生産スケールで実行するのが簡単な毎日の流化基質の供給を素早く設計することができます。

このアプローチを説明するために、IgG1を発現するCHO-K1 GSノックアウト細胞株（GS -/-）のための高機能フェッドバッチプロセスを開発しました。細胞はHyClone™ブランドのActiPro™培地で培養し、HyClone™ブランドのCell Boost™ 7aおよび7bを与えました。最適化された流化基質の供給はシェイクフラスコ（SF）で定義され、その後バイオリアクター（BR）の実験にスケールアップされました。その結果は？ActiPro™のみで培養した場合と比較して、力価のピーク値が5倍になりました（Fig 1）。

Fast and lean workflow developed for a highly efficient fed-batch bioreactor process

Fig 1. 高効率のフェッドバッチバイオリアクタープロセスのために開発された、迅速で無駄のないワークフロー。対象となる細胞株は、Cell Boost™ 7a/bを添加したActiPro™培地で培養。

私たちの目標は、生産性と細胞増殖の停止につながるワークフローの重要なボトルネックを克服するプロセスを開発することでした。流化基質の供給を最適化することで、乳酸やアンモニアなどの有害な副産物を抑え、浸透圧を低く保ちながら、1日に必要な栄養素を適切に供給することができます。

プロセスを開発する一つの方法は、栄養消費率や細胞密度の増加などの計算を含む、連続的または動的な培地添加物の供給に基づいた複雑な供給法を用いることです。その代わりに、私たちは培地添加物を1日1回ボーラスで添加するというシンプルな方法を選びました。実際、以前の実験では、より複雑な供給法が必ずしも高い収穫力価をもたらすとは限らないことが示されています(1)。私たちは、KISS（keep it simple stupid）の原則を用いて、簡単に実行できる堅牢な供給バッチプロセスを開発しました（2）。

私たちは、シンプルな3ステップのアプローチに基づいて戦略を開発しました。まず、シェイクフラスコを使って、3種類のCell Boost™ 7a/7bの濃度を最初にスパイクしたときの影響を確認しました。また、栄養制限と臨界浸透圧を決定しました。次に、シェイクフラスコ内での供給戦略を最適化するため、毎日ボーラスで供給する6つのレジメンを評価しました。最後に、これらの知見を500mLのバイオリアクターに拡大し、2回の実験を行いました。

分析はすべてオフラインで行いました。これらには、生細胞密度（VCD）、生存率、グルコース、乳酸、L-グルタミン、アンモニア、浸透圧、抗体価などが含まれます。詳細はページ下部にあるMaterials and methodsを参照ください。

結果と考察

Step 1：培地添加物スパイクの効果を評価し、臨界浸透圧を決定する

新しいCHO細胞株のフェッドバッチプロセスを開発するためには、まずActiPro™の基本培地にCell Boost™ 7aとCell Boost™ 7bを添加して、その効果をテストすることをお勧めします。これは、単純なバッチ培養で異なる初期（0日目）スパイク濃度をテストすることで行われます。このようにして、栄養制限や栄養供給の改善による影響を確認したり、培養オスモラリティの上昇による影響を推定したりすることができます。また、消費された栄養素や代謝副産物を詳細に分析できるため、サプリメントの効果を確認することもできます。

出発点として、0日目にCell Boost™ 7a/b（a:bの比率が10:1）を1.1%、3.3%、5.5%でスパイクしました。その結果をActiPro™のコントロール培養と比較しました（Fig 2）。

Simple ActiPro™ batch experiments in shake flasks

Fig 2. シェイクフラスコ（SF）を用いたシンプルなActiPro™バッチ実験で、0日目にスパイクした異なるCell Boost™ 7a/b（CB7a/b）濃度の影響を評価。(A) Viable cell density (VCD)とviability; (B) ActiPro™コントロール培養のピーク力価に対する力価値。

ActiPro™コントロールとCB7a/bを1.1%または3.3%添加した培養液は、開始時の浸透圧が異なるにもかかわらず、6日目まで20百万個の生細胞(MVC)/mLという同程度のVCDに成長した。5.5%で添加したCB7a/bは、6日目までVCDが低下し、比増殖も低下したことから、高浸透圧の負の効果が示唆された。6日目以降、ActiPro™コントロールは栄養制限により成長速度が大幅に低下しました。興味深いことに、比成長と生産性の低下は残留栄養素の有無と相関していた

5.5%のCB7a/bを添加したところ、グルコースとグルタミン酸の開始濃度が上昇しました（データは示さず）。その結果、6日目に存在した残留栄養素が7日目以降の高い成長を支えました。これにより、9日目の最終ピークVCDは43MVC/mLまで徐々に上昇し、ピークタイターはコントロールレベルの187%まで上昇しました。

要約すると、Cell Boost™ 7a/7bを添加した培養液は、培養時間が遅くなっても高い比増殖率と生産性を維持していました。これは、高いVCDと相まって、大量のmAbタンパク質を蓄積する原因となる。5.5%のCB7a/bを添加すると、初期成長は低下するが、最終的なピークVCD値は高くなり、6日目までは比生産性がわずかに高く、その後は細胞特異的生産性（qP）が有意に高くなりました。成長初期のqPがActiPro™ベースの培養に比べて高くなったのは、文献でよく報告されているオスモラリティの向上によるものと考えられます(3)。対照的に、後期のプロセス段階では、成長と生産性が向上したのは、栄養供給が維持されたからだと考えられます。

スパイクバッチ実験を用いて、最初の1回のボーラススパイクが細胞の成長と生産性に与える影響を推定し、高パフォーマンスの供給バッチ培養で防止すべき重要な栄養素の制限を特定しました。具体的には、この細胞株では、浸透圧が高くなると比成長が低下することが確認されました。また、グルタミン酸は、今後のフェッドバッチ培養において適切に管理すべき重要な栄養素の一つであることが判明しました。

Step 2：フィーディング戦略の最適化

最近の実験では、Cell Boost™ 7aおよび7bをより複雑な方法で供給しても、1日の固定量に基づいた単純なボーラス供給に比べて実質的な効果は得られないことが示された(1)。後者の供給法は設計、計算、実行が容易です。しかし、栄養制限、乳酸やアンモニア濃度の上昇、臨界浸透圧など、想定される重要なボトルネックを特定する必要があります。そして、それに応じてプロセス制御（供給やベースの添加、CO2のストリッピングなど）を調整しなければなりません。

最適な供給方法を決定するために、シェイクフラスコを用いた小規模な供給バッチ実験を行い、1日のボーラス量を固定したさまざまな供給方法を検証しました。対照として、ActiPro™の基本的なバッチ培養を行いました。

Spike experiments

第1の戦略では、0日目に3.3%のCB7a/bをスパイクしました。第2の戦略では、3.3%のCB7a/bを0日目と4日目の2回、スパイクしました。その結果をFig 3に示します。

Shake flask

Fig 3. 異なるCB7a/bスパイク濃度の影響を調べるためのシェイクフラスコ（SF）バッチ実験。(A)VCDと生存率、(B)ActiPro™コントロール培養のピーク力価に対する力価値。

基底状態のActiPro™を用いて10日間のバッチ培養を行ったところ、24MVC/mLのVCDがピークに達しました。6日目以降は、グルタミン酸を含む重要な栄養素が枯渇したため、細胞の成長が急激に低下しました。同じ日に、グルコースが限界に達し、細胞は乳酸の消費に切り替えた。7日目以降、最終的なピーク力価の上昇は見られなかったため、この値を100%ピーク力価の基準値としました。

最初に3.3%のCell Boost™スパイクを1回使用し（戦略I）、グルタミン酸の制限をさらに1日遅らせた結果、VCDが向上し、ピーク力価が156%に上昇しました。4日目には、提供されたグルタミン酸と合成されたグルタミンが大幅に消費され、浸透圧の低下が観察されました。そこで、戦略IIでは4日目に3.3%のCell Boost™スパイクを2回目に使用しました。これにより、許容可能な低浸透圧でグルタミン酸／グルタミンの制限をさらに1日遅らせることができました。ピークVCD値は33MVC/mLまで上昇し、最終的なピーク力価はバッチ培養に比べて2倍になりました。しかし、最終的な処理時間はまだ10日であした。

Fed-batch experiments

次のステップとして、Table 1に示すように、III、IV、V、VIの4つの戦略で毎日のボーラス供給を評価しました。

Table 1. シェイクフラスコ実験で試した供給方法

Strategy

Cell Boost™ 7a/b concentration

Timing of feed addition
Basal ActiPro™ –Batch 0% NA
I – Spike 3.3% Day 0
II – Double spike 3.3% Day 0 and Day 4
III – Fed batch 1.1% Daily starting on day 3
IV – Fed batch 2.2% Daily starting on day 3
V – Fed batch 1.1%/3.3% Daily 1.1% starting on day 0; daily 3.3% starting on day 7
VI – Fed batch 3.3% Daily starting on day 3 but only if osmolality < 380 mOsm/kg

結果をFig 4に示します。

Shake flask

Fig 4. シェークフラスコ（SF）バッチ実験で、異なるCB7a/bスパイク濃度の影響を調べましたた。各供給バッチ培養は重複して行いました（n=2）。(A)VCDおよび生存率、(B)ActiPro™コントロール培養のピーク力価に対する力価。

戦略IIIでは、3日目から1.1%のCB7a/bを毎日投与したところ、乳酸が3.5g/Lまで蓄積したにもかかわらず、比較的低い浸透圧を維持することができました。バイオリアクターでは、浸透圧が低ければ、pHの低下を調整するために塩基を添加する余地があります。しかし、毎日の培地添加物の供給では、6日目以降、重要なグルタミン酸／グルタミンレベルを維持することができず、8日目には40MVC／mLで成長が停止し、最終的な相対ピーク力価は232％となりました。また、グルコースストックを添加していたため、乳酸のシフトは観察されませんでした。

戦略IVでは、3日目以降、1日の培地添加物の供給量を2.2%に増やしたところ、浸透圧が上昇し、6日目に350mOsm/kgで最初のピークを迎えました。その後、グルタミン酸が急速に消費され、8日目には限界に達し、さらに1日後には成長と生産性が停止しました。8日目までは、VCDが最も高く、オスモラリティが低いという有望な結果が得られたため、培地添加物やベースを追加する余地がありました。

3日目から3.3％の培地添加物を毎日与えた場合（ストラテジーVI）と、0日目から1.1％の培地添加物を与え、細胞の必要性に応じて培地添加物の添加量を調整した場合（ストラテジーV）に、総合的に最良の成績が得られました。戦略VIでは、浸透圧が380mOsm/kg以上の臨界レベルに達した時点で供給を中止し、戦略Vでは、浸透圧の急激な低下によってグルタミン酸とグルタミンが急速に消費された時点で供給量を3.3%に増加させました。興味深いことに、両培養系とも最終的な培地添加物量は同程度でした。他の培養方法と比較して、3日目以降は比較的大量の培地添加物を与えたため、グルコース、グルタミン酸、グルタミンのピーク値が高くなり、その結果、オスモラリティも高くなりました。戦略Vと戦略VIの両方とも、ActiPro™バッチ培養と比較して、力価が約5倍になりました。しかし、VI法は8日目から供給するというシンプルな方法だったので、バイオリアクターの検証にはVI法を選びました。

6つの戦略すべての結果を、ベースとなるActiPro™培養液と比較した結果をTable 2に示します。

Table 2. シェイクフラスコ実験で試した供給方法

Strategy

Cell Boost™ 7a/b concentration (%)

Timing of feed addition

Cumulative feed amounts (%)

Cumulative 250 g/L glucose stock addition (%)

Relative integral of VCD

Relative peak titer
Basal ActiPro™ –Batch 0 0 0 100% 100%
I – Spike 3.3 Day 0 3.3 0 113% 156%
II – Double spike 3.3 Day 0 and Day 4 7 0 128% 209%
III – Fed-batch 1.1 Daily starting on day 3 9 3.8 259% 232%
IV – Fed-batch 2.2 Daily starting on day 3 15 3.2 297% 279%
V – Fed-batch 1.1/3.3 Daily 1.1% starting on day 0; daily 3.3% starting on day 7 21 4.9 369% 473%
VI – Fed-batch 3.3 Daily starting on day 3 but only if osmolality < 380 mOsm/kg 23 3.5 371% 484%

Step 3：バイオリアクターでの検証と調整

最適な供給方法とボトルネックとなりうる供給方法を特定した後、そのプロセスをバイオリアクターの検証運転に移すことができました。小規模な振とう実験は、さまざまな条件をハイスループットで最適化するのに非常に適しています。しかし，最終的なバイオリアクターの運転では，性能が振とう実験とは異なる場合があります。その主な理由の1つは、バイオリアクター内のpHと溶存酸素が制御されていることです。前者はCO2ガスのレベルや塩基性溶液の添加によって変化し、後者は酸素濃度、ガス流量、攪拌機の速度、スパージャーのデザインによって変化する。これらのプロセス変数はすべて、セルの性能に大きな影響を与えます。例えば、酸性の環境では比増殖が低下することは広く認められており、文献にも示されています(4)。したがって、バイオリアクター内の供給法は、小規模なシェーカー実験で確立した供給法から、細胞の必要性に応じて変更する必要があります。

2つの類似したバイオリアクター戦略（BR IおよびBR II）を並行してテストし、最初の4日間の培養では、最適なシェーカー戦略VIに従って供給しました。

Bioreactor verification run

Fig 5. バイオリアクターの検証運転。(A)VCDと生存率；(B)ActiPro™のベースとなるバッチ培養のピーク力価に対する力価値。バイオリアクターの培養は二重に行いました。

この例では、バイオリアクターのpH設定値を6.9とし、最適な生育と最小限の塩基添加を両立させました。シェイクフラスコ（SF）培養の最初の2日間は、高い初期増殖率が観察されました。3日目には，SFでのVCDが2.8 MVC/mLに達し（Fig 5）、培養液に乳酸が1.7 g/Lまで蓄積するとpHが大きく低下しました（データは示していません）。バイオリアクターでは、3日目にCO2の添加を停止し、続いて塩基を添加することで、pHを一定のpH6.9に制御しています（Table 3）。

Table 3. 500mL DASGIP™バイオリアクター(BR I)培養のプロセス制御概要*

CB7a/b (% w.v.)

Gluc stock (g/L)

Total Gluc (g/L) (CB7a/b + stock)

RPM/flow (L/h)

pH.SP/XCO2 (%)/cum. base (mL)

Comments
Day 0 0% +0 +0 80/3 6.9/15/0 3 critical parameters: i) nutrient ii) DO iii) pH
Day 1 0% +0 +0 80/3 6.9/13/0
Day 2 0% +0 +0 80/3 6.9/10/0
Day 3 3.3% +0 +2 80/3 6.9/3/0
Day 4 3.3% +0 +2 80/3 6.9/3/9
Day 5 3.3% +0 +2 80/3 6.9/3/18
Day 6 3.3% +2 +4 100/9 6.9/0/20
Day 7 6.6% +2 +6 150/18 6.9/0/27 SF: critical osm BR: Glu/Gln and NH4+ (!) low
Day 8 6.6% +0 +4 180/20 6.9/7/27 SF: gluc limit, lac consumed
Day 9 3.3% +0 +2 180/20 6.9/15/27 BR: osm critical, Glu/Gln increased
Day 10 0.0% +3 +3 180/20 7.0/18/27 BR: critical Osm, no feed needed, Gluc/Lac limit (only Gluc), pH.SP 7.0
Day 11 0.0% +2 +2 120/9 7.0/30/27 BR: no feed needed (Glu/Gln), only Gluc
Day 12 0.0% +2 +2 120/9 7.0/30/27

* Cell Boost™ 7aおよび7b（CB7a/b）の添加は、実際の作業量に対する割合（% w.v.）で表されます。最終的なグルコース濃度の向上はg/Lで示され、CB7a/bの添加による寄与、または250g/Lグルコース原液の個別添加による寄与を含みます。撹拌機の回転数（rpm）、ガス流量（L/h）、pH設定値（pH.SP）、入口ガス中のCO2濃度（XCO2）、累積ベース量（mL）などバイオリアクターの重要なパラメータも追加で示しています。

培養液のpHが高くなった結果、バイオリアクターの培養液は4日目と5日目に高い比増殖を示し、グルコースの消費量が増加しました。乳酸値は最大3.9g/Lの危機的レベルに達しました。そこで、乳酸の蓄積、塩基の添加、最終的な浸透圧を低レベルに保つため、5日目にレスキュー戦略（BR II）を並行してテストすることにしました。一方、バックアップ培養では、5日目に培地添加物の添加を中止したところ、その翌日には培養液のグルタミン酸、グルタミン、アンモニアの濃度が急激に低下しました（データは示さず）。さらに、グルコースレベルが限界に達したため乳酸シフトが誘発され、その結果、BR Iに比べてレスキュー戦略（BR II）では塩基添加量が減少し、オスモラリティが大幅に低下しました。

培養液BR Iの供給は、5日目に3.3%のCB7a/bを継続した。CB7aには約70g/Lのグルコースが含まれているため、培地添加物液から2g/Lのグルコースを添加した（Table 3）。6日目には培養液中のグルコースの測定値が1.9g/L減少しており、5日目から6日目までに3.9g/Lのグルコースを消費した計算になる。そのため、6日目にはCB7a/b添加により2g/Lのグルコースを添加し、さらにグルコースストック液により2g/Lを添加することで、乳酸の蓄積を抑えつつ、高い生存率と成長率を維持することができました（Table 3）。

すでに6日目には、グルコース、グルタミン酸、グルタミン、アンモニアの濃度が低下した結果、BR戦略のいずれもSF VIに比べてオスモラリティが低下しました。これは、グルコース、グルタミン酸、グルタミン、アンモニアの濃度が低いためです。内因性グルタミン合成のためにアンモニアが大量に消費されたため、BR IIでは6日目、BR Iでは7日目にアンモニアが危機的に低いレベルに達しました。したがって、グルタミン酸とアンモニアのレベルが制限されるのを防ぐために、BR Iでは7日目と8日目に1日の培地添加物の供給を6.6%に増やすことにしました。

9日目には、2つのBRを複製した培養液はいずれも400mOsm/kgの臨界値を超え、比増殖が低下しました。さらに、グルタミン酸濃度は安定したままで、グルタミンが培地に蓄積しました。そこで、培地添加物量を3.3%のCB7a/bに減らすことにしました。10日目、生存率はわずかに低下し、アンモニア濃度の急激な上昇が観察されましたが、これは供給バッチ式培養の後期段階であることを示しています。測定されたグルタミン酸レベルは上昇し続けたため、毎日のCB7a/b添加を中止し、最後の数日間は、すでに臨界浸透圧に達しているグルコースのみを与えることにしました。

Table 3に示すように、最適化されたバイオリアクターのフェッドバッチ設定を用いることで、培養液は最大60 MVC/mLという非常に高いVCD値を達成し、最高の小規模シェイクフラスコ実験と同等のピークタイターを得ることができました。この結果は、基本的なActiPro™バッチ実験と比較して5倍の改善となりました。

結論

ここでは、高性能なフェッドバッチプロセスを実現するための簡単な方法を紹介します。このワークフローでは最初にスパイクバッチ実験を行い次にシェイクフラスコを用いたフェッドバッチの最適化を行い最後にバイオリアクターの最適化を行うことで、IgG1を発現する組換えCHO-K1 GS -/-細胞株のフェッドバッチプロセスを最適化することができました。その力価は、単純なActiPro™バッチ培養での力価よりも500％高かくなりました（Fig 6）。重要なことは、力価の上昇と累積生細胞密度（IVCD）の積分値との間に相関関係（ピアソン相関r=0.9）が認められたことです。これは、収穫物の力価を大幅に向上させるためには、高い生細胞密度が必要であることを強調しています。

Improvement of harvest titer together with the cumulative integral of viable cell density

Fig 6. 実証されたフェッドバッチ開発のワークフローを用いて、収穫物の力価と累積生細胞密度（IVCD）の積分値を向上。力価とIVCDの値の間には、ピアソン相関係数r=0.9が見られた。

初期のバッチテストでは、グルタミン酸が最も重要な必須栄養素であり、不足すると細胞の成長が制限されることが明らかになりました。さらに、高浸透圧では成長率の低下が観察されました。これらの結果から、浸透圧を低く保ちつつ、重要なグルタミン酸レベルを維持するためには、より洗練された供給法が必要であることが示唆されました。KISSの原理に基づいたシンプルな供給法は、小規模なシェイクフラスコ培養でハイスループットの供給バッチスクリーニングを可能にします。このような戦略は、単純な1日のボーラス供給量に基づいており、最適化された場合には、収穫力価と最終的なIVCDが大幅に増加しました。バイオリアクター内の細胞は、主に溶存酸素とpH値がバイオリアクター内で定義されたセットポイントで制御されているため、シェイクフラスコ培養とは異なる挙動を示す可能性があります。

開始時のpH設定値を6.9としたところ、バイオリアクター内の初期成長速度が上昇し、グルコースの取り込みと乳酸の分泌が増加しました。その結果、細胞に十分な栄養素（グルタミン酸）を供給しつつ、乳酸などの毒性副産物を最小限に抑えるために、シェイクフラスコで最適化された培地添加物戦略は、特定の時点で培地添加物の添加を停止したり、培地添加物の量を増やしたりして調整しました。後者の場合、塩基の添加を最小限に抑え、オスモラリティを低濃度に保つことで、培地添加物を追加する余地を残しました。

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Acknowledgements

データの使用を許可していただき、示唆に富んだ議論をしていただいたHorizon Discovery社に感謝します。