閉鎖系の接続されたプロセスを最初から最後まで実行するための教訓

バイオマニュファクチャリングは、コスト削減や救命治療を必要としている人々への迅速な提供など、市場の要求に適応するための圧力が高まっています。これらの目標を達成する方法の一つとして、密閉型のシングルユースプロセスがあります。クローズドプロセスの利点としては、処理時間の短縮、プロセス中の手作業の削減、資本支出（CAPEX）の削減、洗浄やバリデーションのためのリソースの削減、製造スペースを確保するためのフットプリントの縮小などが挙げられます。

閉鎖系の接続されたプロセスには利点がある一方で、プロセスの開発、計画、実行に関しては新しいアプローチが必要です。新しいプロセス手法の評価には時間と資源が必要であり、しばしば遅れたり中断したりすることがあります。私たちは、効率を改善できる可能性のあるバイオマニュファクチャリング技術の評価を行い、その結果を、これらの方法を採用する際に検討すべき追加データとして提供します。このディスカッションの目的は、製造スケールでのプロセスを方向付ける小規模なモデル化を含め、設計の検討からスケールアップまで、クローズドでコネクテッドなmAbプロセスの実行から得られた推奨事項をまとめることにあります。

閉鎖系の接続されたプロセスの設計

考えることが重要になってきました。その一つが、閉鎖系の接続されたプロセスの導入です。閉鎖系の接続されたプロセスを成功させるためには、準備段階での努力と、特に設計上の配慮が必要であることは言うまでもありません。従来のバイオプロセスと比較して、閉鎖系の接続されたシングルユースプロセスを設計、実行、実施する際には、「Process considerations for closed connected processing」で説明したように、計画と準備の段階に焦点を当てるべきである。先を見越した計画を立てることで、リスクを予測・軽減し、プロセスの最終的な実行をシームレスに行うことができます。

規模や機器のベンダーによっては、シングルユースの生産バッチで管理すべき部品の数が多くなります。それぞれの接続部の適合性と機能を検証し、共通項を検討して単回使用の消耗品を統合することで、部品の総数を減らすことに注意しなければなりません。

接続されたプロセスでは、異なるユニットオペレーションを接続するチューブの長さを慎重に検討することが重要です。汚染リスクの観点から、チューブの長さをできるだけ短く設計することは、セットアップの調査を容易にし、液体の移送を容易にし、チューブ内のデッドレッグや損失を最小限に抑えるために有益です。このようなセットアップは慎重に計画する必要があり、使用する機器の外観、サイズ、コンテキストなどの知識が必要です。

当社の上流工程で学んだ教訓は、ラボで接続を可視化し、チューブがどこに行くのか、どこで接続を行うのかをマッピングすることでした。閉鎖的に接続されたプロセスでは、オペレーターがプロセスラインへのチューブの接続を解除したり、再接続したりすることができないため、プロセス変更の柔軟性は限られています。柔軟性を高め、臨機応変な調整が可能なセットアップにするには、フィルターやバッファーバッグの追加接続が必要な場合、重要なポイントにY型またはT型のマニホールドを追加するとよいでしょう。

また、プロセスを紙面上に描き出すだけでなく、プロセス全体を設定してドライランを行い、安全性や汚染のリスクとなるアクセス制限や配管網・交差部などの問題を現実的に確認することも重要でした。今回の設計では、そのような問題がいくつか見つかりましたが、それはプロセスのシミュレーションを行うという付加的なステップを踏んだことで改善されました。この時点で、すべてのシングルユースコンポーネントの部品表を作成し、リードタイムを確認して、供給保証計画を立てることが賢明です。今回のプロジェクト計画では、新しいプロセスであるため、余分なコンポーネントが含まれていました。これは、プロセスが定義され、供給と実行の両方が正常に終了した後、余分なセットを1つに減らすことができます。

接続されたプロセスでは、有害な違反や遅延の原因となる単位操作のサイジングの不一致を避けるために、マスバランスを理解することも重要です。接続されたプロセスでは、プロセスフロー、タイター、キャパシティ、収率が前もって十分に理解されていなければ、接続されていないプロセスほど寛容ではありません。

よく知られているプロセスでは、カラムサイズやその他の消耗品、機器を現在のスケールに合わせることは全体的に簡単です。しかし、プロセスのパラメータや結果がより不確実な開発段階では、変動を予測し、マスバランス計算における安全マージンを考慮することが重要です。例えば、PrismAカラムのサイズは、ある程度のオーバーキャパシティを考慮して設計されているため、力価が見積もりよりも高くなった場合でも、生成されたすべての材料を処理することができました。一方、Capto™ S Impactを使用した研磨工程では、カラムのサイズが不足していました。材料を無駄にしないために、追加のアウトレットポートを接続することで、クローズドなセットアップを崩すことなく、必要に応じてより多くのサイクルを実行することができます。

また、スケールと推定される製品収量に基づいて、必要なバッファーの量を計算しました。ストック液からのバッファの調製には、インラインコンディショニング（IC）スキッドを使用した。ICシステムは、あらかじめ作られたストック液をインレットに接続し、バッファーキッチンとして設置された。ICは、特にクロマトグラフィースキッドとして使用した場合、バッファをカラムに直接供給することで、容量を減らし、保管場所を確保するのに役立ちます。

緩衝液や培地がプロセス中に枯渇しないように、約20～30％の余分な緩衝液を用意しました。50Lの灌流式バイオリアクターでは、約800Lの細胞培養液が必要になると思われますが、25％の安全率を考慮して1000Lにしました。推奨される方法としては、できるだけ多くのバッファーに同じストック液を使用することです。さらに、バッファーの準備の際には、プライミングの必要性を最小限にするために、同じストック液をベースにしたバッファーを順次作成することをお勧めします。

プロセス最適化研究

ーー灌流式細胞培養の歩留まりを向上させる小規模なモデル

閉鎖系の接続されたプロセスを成功させるためのもう一つの重要な要素は、大規模生産を行う前に重要なプロセスパラメータを特定し、評価することである。例えば、製品とバッファー/メディアの組成と量、製品の中間量、プロセス設定に関するホールドタイムの研究を計画段階で確立する必要があります。小規模な研究は、大規模な逸脱の結果としてではなく、管理されたプロアクティブな方法でリスク軽減戦略を通知するのに役立ち、スケールアップの成功の可能性を高めることができる。これは常識的なことのように思えますが、ここでの課題は、大規模なプロセスの優れた小規模なレプリカを作成することです。小規模な機器やプロセスのダイナミクスは同じではない場合があり、大規模なデータの適用性を評価することはしばしば困難です。

大規模灌流プロセスの歩留まりを向上させるプロセスパラメータを明らかにするために、ReadyToProcess WAVE™ 25 RockerバイオリアクターとWAVE™ Cellbag™ 50 Lを用いて小規模灌流モデルを開発しました。

温度の影響については、まずTPP® TubeSpin®バイオリアクターチューブ（50mL）にチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞を入れ、腐植化したシェイクインキュベーターで試験を行いました。このチューブスピンの設定では、37℃から31℃への温度シフトの影響の可能性と、この温度シフトを導入した時間が細胞培養の生産性に影響を与えるかどうかを調査しました。その結果、温度シフトは細胞株の生産性を向上させないことがわかり、ReadyToProcess WAVE™ 25の灌流培養は37℃で行われました。

また、TubeSpinの実験では、最適な生細胞密度とその生産性との関連性を調べました。この実験から得られたデータによると、より高い生細胞密度で動作させると、製品の総収量が40％増加することが分かりました。この情報は、大規模な接続プロセスのプロセスパラメータを設定するために使用されました。50LのWAVE™ Cellbag™バイオリアクターへのスケールアップに成功し、合計12日間の運転を行いました。毎日の収穫サンプルは、70 MVC/mLに制御された状態で収集され、3日間の平均生産量は0.85 g/L/dでした。

ーーダウンストリームプレスタディ

HiScreen™プレパックドカラムとHiTrap™ PrismA Fibroユニットを用いて、低pHのウイルス不活性化を含む標準的なMabSelect PrismA™メソッドをラボスケールで評価しました。ランニング条件、動的結合容量、製品の安定性などを調査し、すべての個別のユニット操作におけるスケールアップの基礎を理解しました。

Capto™ S ImpActステップは、mAbにとって好ましい条件と考えられたため、pH5.0で評価されました。最適化後、50mM酢酸ナトリウム、200mM NaClを用いたステップ溶出を行ったところ、濃縮された溶出ピークと、宿主細胞タンパク質（HCP）および残留プロテインAの高い減少を伴う堅牢な分離が得られた。その後、負荷量が分離や溶出プロファイルに影響を与えるかどうかを理解するために、異なるカラム負荷量で研究を行いました。このステップのパフォーマンスはカラム負荷に依存しないことが示され、スケールアップする前の有益な情報となりました。

最終的な研磨ステップとして、フロースルー・モードのQメンブレン・アドソーバーを使用し、pH7.5での初期試験を行いました。その結果、フロースルー方式のQメンブレンアドソーバーでは、HCPが大幅に減少し、DNAレベルも概ね検出限界以下になりました。しかし、抗体の安定性の問題が見られ、このpHでは高分子量（HMW）のレベルが著しく上昇しました。追加実験の結果、この工程ではpH6.0が最適な条件であることがわかりました。

最後に、計画していた大規模プロセスの縮小モデルを確立し、プロセス全体を確認するために完全なプロセスの実行を行いました。最終工程でのウイルスの不活性化を含む、3つのクロマトグラフィーステップの合計収率は88％であった。

プロセスの実行

ーー大規模な連結灌流細胞培養

上流工程では、Xcellerex™ XDR50バイオリアクターにXcellerex™自動灌流システム（APS）を接続し、細胞の採取から生成物の回収までを連続的に行いました。その後、製品はXcellerex™ XDM 200ホールドタンクに回収され、後続の下流工程に送られた（Fig.1）。

灌流法は、バッチ法やフィードバッチ法と比較して、細胞に常に新鮮な栄養分を供給し、同時に廃棄物を除去することで、長時間の連続運転を可能にする。灌流法の目的は、歩留まりの向上、処理の高速化、材料の最適な使用、全体的な設置面積の縮小、製品品質の一貫した向上など、効率性の向上にあります。

この接続された上流工程では、Xcellerex™ APS灌流システムが重要な役割を果たした。このシステムは、中空糸マイクロフィルターを細胞保持手段として利用しています。タンジェンシャルフローろ過（TFF）ベースのシステムは、プロセス液を中空糸フィルターに通してバイオリアクターに戻すための低せん断ポンプで構成されている。灌流液の供給、透過液の採取、細胞の排出のためのポンプは、フィードバックコントローラで制御されます。シングルユースの圧力センサーにより、膜間圧力（TMP）と圧力差（デルタP）をオンラインで連続的にモニタリングし、フィルターの性能を最適化する。ランの全行程において、フィルターのファウルや目詰まりは発生せず、1つのフィルターのみが使用された。これは、時間とコストを節約し、フィルターを交換するためにシステムを切り離すリスクを減らすために、非常に重要なことです。APSに搭載された自動化機能は、灌流速度とブリード速度を自動的に変更することで、日々の作業を簡素化した。しかし、すべての自動化に共通して、複雑な操作が必要となるため、オペレーターの適切なトレーニングが重要となる。

結論として、70 MVC/mLという高い細胞密度を達成し、10日間で90％以上の細胞生存率を得ることができました。さらに、この細胞収穫により、1日平均0.72g/LのIgG力価が収穫用ホールドバッグに供給され、20pL/細胞/日の細胞特異的灌流速度（CSPR）が維持されました。

ーー大規模クローズドダウンストリーム精製プロセス

下流の精製は、一般的にレジンベースのクロマトグラフィー法で行われています。最近では，効率性を向上させたファイバーベースの新しいクロマトグラフィー法が登場している。本研究では、レジン系クロマトグラフィーと繊維系クロマトグラフィーの性能を評価するために、図2に示すように精製工程を2つに分けて実施しました。1日目から5日目までの収穫物は、ReadyToProcess™ MabSelect PrismA™カラムを用いてキャプチャーステップで精製した。一方、6日目から10日目までの材料は、Fibro PrismAユニットを使用して精製した。Fibro PrismAユニットは、キャプチャーステップで数分以内に精製サイクルが可能なファイバーベースの技術を利用している。

2つの研磨工程は、コンディショニングのためにホールドバッグを挟んで、ÄKTA™システムを介して物理的に接続されました。Capto™ S ImpAct to Q Adsorberで行ったように、2つのステップを閉じた形で接続することは、効率化と集約化に関する多くの利点があります。製品を瞬時に調整し、保存せずに直接処理できるため、中間製品の取り扱いを最小限に抑え、汚染のリスクを低減することができます。さらに、製品を保管せずに直接処理する場合、研磨工程の間に無菌ろ過や保管は必要ありません。また、製品の安定性の観点からも、ステップをつなげて直接プロセスを継続することにメリットがあると考えられます。私たちのラボスケールの実験では、最初の研磨ステップからの溶出液が保存中に不安定であることがわかりました。そのため、保存前に製品をより適切な緩衝液に保つために、直接処理する必要がありました。

Fig 2に示すように、プロセスのプーリングポイントでは、実用上の理由から短い中間ホールドが含まれています。完全に自動化されたプロセスラインでは、すでに使用されている機器を分解したり、次のユニットオペレーションのために機器をセットアップしたりするために必要なのです。また、スケジューリングのために、通常の勤務時間や週末に対応するために、毎日のプロセスホールドが必要です。プロセスホールド中に製品の品質を確保するためには、関連する条件での中間体の安定性を評価することが重要である。

大規模なダウンストリームプロセスの実行中に、小規模な研究では見られなかった2つの発見がありました。まず、ウイルスの不活性化工程では、サブバッチごとに異なる凝集体形成の大きな増加が観察されました。この凝集体形成の増加は、酸を添加した際に酸濃度が高くなって体積が大きくなり、局所的なスポットができたためと考えられる。この結果は、スケールアップしてウイルスの不活性化を行うには、さらなる最適化が必要であることを示している。このステップのパフォーマンスを向上させるためには、ロッキングレート、酸の種類、その濃度、および酸の添加率をさらに評価する必要がある。次に、MabSelect PrismA™カラムを使用したプロセストレインでは、ウイルス不活性化ステップの収率にもばらつきがありました。最初の2つのサブバッチではボリュームロスが大きく、最後の3つのサブバッチではボリュームロスが小さかった。最初の2つのバッチで体積損失が大きかったのは、ろ過ステップで表面積の大きい0.2µmフィルターを使用したためと考えられます。

どちらのプロセスセットアップでも、重要な品質属性の観点から高品質の最終製品が得られました。さらに，プロセス全体を通してバイオバーデンとエンドトキシンのレベルをモニターし，セットアップの無菌状態を実証した。分析した中間体の大部分からはバイオバーデンが検出されず，再検査の結果，ハーベストタンクの下流で採取したすべてのサンプルに汚染はなく，エンドトキシンレベルも検出限界以下であった。2つのプロセスの主な違いは、処理時間でした。ReadyToProcess™ MabSelect PrismA™の処理時間は約7.7時間/サブバッチでした。一方、Fibro PrismAのランのプロセス時間は約3.0時間/サブバッチであり、大幅なプロセス時間の短縮となった。

Fibroユニットとカラムのセットアップは、Xcellerex™ APSから直接送られてくる灌流物質の処理に適しており、追加のフィルタリングは必要なかった。5日間の使用期間中、カラムもフィブロユニットも目詰まりや圧力上昇は見られなかった。ファイブロのプロセスをスケールアップする際に考慮すべき重要な点は、大規模な装置は通常、カラムを使用するために設計されているということです。ファイブロユニットは、対応するカラムの10倍以下の大きさであることが多いが、ファイブロの流量は高い。大規模装置の流路内のデッドボリュームは、カラムに比べて小型のユニットに大きな影響を与えるため、ピーク捕集基準を設定する際にはこの点を考慮する必要があります。大規模な装置で数サイクルの評価を行うことで、最適な捕集が可能になります。

また、高速循環型のフィブロ・クロマトグラフィーは、非常に高速な物質移動により生産性が向上し、サイクルタイムは数時間ではなく数分になりました。これは今回のセットアップで非常に有効でした。プロセスの途中で、バイオリアクターから予想以上に多くの物質が排出されるようになりました。これは良いことであっても、このような接続されたプロセスでは、下流の課題につながる可能性があります。しかし、私たちの場合、Fibroテクノロジーのサイクルタイムが非常に速いため、予定していた1日7回のサイクルを10回にすることができ、バイオリアクターからのすべての材料を1営業日で処理することができました。これらの追加サイクルに必要な時間は1時間以内で、バイオリアクターからの出力を無駄にすることはありませんでした。

UF/DFステップのプロセスは、シングルユースのフローパスとUNICORN™メソッドを備えたÄKTA ready™ fluxを用いて自動的に実行されました。この設定により、バッチ間で一貫して高い収率が得られると同時に、プロセスの操作が簡単で便利になりました。メソッドを開始する前に、すべてのプロセスバッファと溶液を接続することができ、プログラムされたメソッドは、プロセスのさまざまな段階を段階的に進め、フィルターを通過するフラックスの変化に合わせてTMPを自動的に調整します。オペレーターは、画面上で現在のオープンフローパスを確認し、レテント液の重量と透過液の流量を継続的にモニターできるため、プロセスの概要を把握することができました。

ディスカッション

N-1ステップから最終的なろ過ステップまで、クローズドでつながったプロセスに注目すると、通常のバイオプロセスに比べて計画段階がより重要になります。しかし、すべてが終わった後、関係するチーム間のコミュニケーションが成功の真の鍵となります。そのために、上流と下流のチームではなく、アジャイルな方法で1つのチームとして緊密に連携しました。チーム全員との定期的なミーティングは、集中的な実行期間中、週に2回から毎日行われました。すべての分野における依存関係は、短いスクラムミーティングで整理され、スクラムボードで状況が完全に可視化されるため、進捗状況の確認や潜在的なリスクの特定が容易になりました。また、オープンでダイレクトなコミュニケーションを促進し、チーム全体の柔軟性を実現しました。成功への大きな影響は、目標を明確に示し、チームメンバー全員がそれにコミットし、アジャイルな働き方と透明なコミュニケーションを実現したことです。

プロジェクト全体を通して、チームの重要な活動は、新しいリスクを特定し、定期的にそのリスクを軽減し続けることでした。このようにチームで決められた仕事の進め方をすることで、リスクに積極的かつ継続的に対処することが容易になりました。

計画段階では、閉鎖系の接続されたプロセスの設計と実装に不可欠な2つの技術、すなわちシングルユース（SU）コンポーネントとセンサーを特定しました。クローズドプロセスでコンタミネーションのリスクを低減し、製品の品質を維持するためには、検証済みのアセプティックコネクターを用いてユニットオペレーションを接続することが重要である。アセプティックコネクターは、シングルユースコンポーネントとして、接続タイプと切断タイプの両方があります。現在のところ、接続に関する業界標準はなく、いくつかの異なるフィッティングが存在する。そのため、各ユニットオペレーションのための様々な接続が確実に合うように、各接続をマッピングすることが重要である。無菌コネクタを選択する際には、アクセスのしやすさと、プロセス・ストリームとサンプルの両方に対する無菌性の保証を考慮する必要がある。サンプリングの位置や問題の切り分けの重要性についても、事前に慎重に検討する必要があります。

一般的に、センサーが重要なパラメータをモニターするように設計されていれば、クローズドプロセスで必要なサンプル数は少なくて済みます。また、センサーを使用することで、オンラインまたはインラインでのサンプリングによる汚染のリスクをさらに減らすことができます。生細胞密度のモニタリングには，使い捨てのフローメーター，ロードセル，圧力センサー，pH，導電性センサーに加えて，様々なシングルユースの静電容量センサーが利用できる。本研究では、せん断速度の厳密な制御、新鮮な培地の添加のモニタリング、および大規模灌流プロセスにおける使用済み培地の除去のために、フローセンサーと重量計を使用した。小規模な研究の経験から、このような自動モニタリングなしに大規模な連続灌流プロセスを成功させることは、難しいというか不可能であることがわかりました。

まとめ

バイオメーカーは、製品の品質を確保しつつ、製造方法、コスト、タイムラインを常に改善しようと努力している。新しい技術や方法論の評価は難しいものです。本研究では、灌流細胞培養、ファイバーベースのクロマトグラフィー、単回使用の閉鎖系の接続されたプロセスなど、製造における多くの新しいトレンドに挑戦した。

私たちは、非分類区域でクローズドな接続プロセスを成功させることが可能であることを示しました。ReadyToProcess™のディスポーザブルソリューションを使用したクローズドセットアップがこれを可能にし、バイオバーデンとエンドトキシンのレベルが低いことから、私たちのプロセスセットアップの成功が確認されました。ディスポーザブルソリューションに基づいてプロセスを実行するためには、すべての消耗品を日々適切にロジスティックスする必要があり、実行前に適切な計画を立てる必要があります。また、優先順位が低くなりがちなポイントとして、チューブの交差を避け、バッファ容器の設置面積を最小限にするために、すべてのバッファをプロセスステップごとに配置することが挙げられます。最後になりましたが、分野を超えたチームと複雑なプロセスを必要とするプロセスの実行には、コミュニケーションが欠かせません。アジャイルな作業方法を活用することで、コミュニケーションとチームの相互依存関係の確認が容易になり、コントロールできるようになりました。

従来の切断されたバイオ製造プロセスではなく、閉鎖された接続プロセスを使用することには多くの利点があります。これらの利点には、処理時間の短縮、プロセス中の手作業の減少、CAPEXの減少、洗浄やバリデーションのためのリソースの減少、製造スペースの縮小などがあります。今回のケーススタディでは、適切な計画、導入、技術により、製造要件を満たしながら高品質な製品を生み出すことができる大規模な連続プロセスを開発することが可能であることを示しました。