浮遊細胞を用いたAAVベクター製造のための細胞培養プロセス開発

付着性のHEK293T/HEK293細胞を当社のHyClone™トランスフェクション培地HyCell™ Transfx-H で懸濁培養に馴化させました。この実験により、単一使用バイオリアクターを用いたスケーラブルな生産に向けた今後の作業に必要な、集団倍加時間による細胞の増殖、形態、生存率に関する情報が明らかになりました。

本ページでご紹介する一過性のトランスフェクションプロトコルの開発は、汎用性があり、異なるアデノ随伴ウイルス血清型に使用できます。実験計画法（DoE）を用いて、生産性に影響を与えうるいくつかの異なるパラメータを評価し、ウイルス粒子/L（VP/L）、ウイルスゲノム/L（VG/L）、フルキャプシドの割合として測定しました。

はじめに

ウイルスベクター は、特定の組織への遺伝子導入や、細胞型の改変を誘導するために、ますます使用されるようになってきています。遺伝子治療のための最も有望なベクターとして組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）を中心に、いくつかのウイルスが細胞および遺伝子治療への利用について研究されています。

細胞・遺伝子治療業界では、cGMP（current Good Manufacturing Practice）による効率的なウイルスベクターの大量生産の確立に努めています。rAAVの臨床使用に必要な量を大量に生産するために、企業は接着したHEK293細胞による生産から、よりスケーラブルな浮遊細胞培養による技術へと移行しています。さらに、一過性のトランスフェクションプロトコルは、より大規模で効率的な懸濁液への最適化も行われています。

ここでは、実験計画法（DoE）を用いて、HEK293T浮遊細胞系でのrAAV産生の最適化を行った。AAV製造のための効率的でスケーラブルな細胞培養プロセス-当初はrAAV2血清型をrAAVのモデルとして使用されていた-は、rAVV5についても検証されました。

実験は、2つのステップで行われます：

rAAV-2の生産には、HEK293細胞および変種でのrAAV-2生産に必須な遺伝子を提供する3重プラスミドトランスフェクションシステムを使用しています。まず、E2A、E4、VA遺伝子を搭載したpHelperプラスミドである。2番目は、特定の血清型用の複製およびキャプシド（rep/cap）プラスミドである。3つ目は、関心遺伝子（GOI - この研究ではGFP遺伝子）と、ウイルスの感染性を維持するために不可欠な逆末端反復配列（ITR）を持つプラスミドである（Fig 1）。

Fig 1. 3重プラスミドトランスフェクション法を用いた馴化HEK293T細胞の一過性トランスフェクション。ポリエチレンイミン（PEI）がDNAと複合体を形成し、宿主細胞内に導入されます。

本アプリケーションで説明するAAV製造のアップストリームの戦略は、Fig 2にまとめたとおりです。

Fig 2. 私たちの戦略は、AAV製造のスタートからフィニッシュまでのプロセスを開発することです。この記事では、細胞培養とトランスフェクションのプロセス開発の詳細について紹介します。

詳細な材料と方法は、本記事の最後にあります。

HEK293T細胞のAAV産生用無血清プロセスへの適合性

付着性のHEK293T細胞をHyClone™細胞培養トランスフェクション培地、HyCell™ TransFx-Hに馴化させました。馴化のための詳細なプロトコルは材料と方法に記載しています。並行して、HEK293細胞（SV40ラージT抗原なし）も、同じ戦略を用いて同じ培地に馴化させることに成功しました（データは示していません）。

馴化は、10% HyClone™ Fetal Bovine Serum (FBS)を添加した従来のHyClone™ DMEM/High Glucose培地で培養した細胞を直接新しいトランスフェクション培地に移植することにより行いました。培地には、4 mMのHyClone™ L-グルタミンと0.1%のPluronic™ F-68 (Thermo Fisher Scientific™)を添加しました。HEK293T浮遊細胞の細胞増殖と形態は、それぞれの無血清培地で10回継代して顕微鏡で評価しました。凝集を避け、シアストレスを軽減するため、馴化初期からPluronic™-F68を使用し、細胞密度を2.5×10⁶ cells/mL以下に抑えました。

HyClone™培地に馴化した細胞は、我々が設定した成功基準である10%の凝集（10個程度の小さな集合体）を満たし、細胞は順調に増殖した。研究用セルバンクとワーキングセルバンク（それぞれRCBとWCB）を作りました。HyCell™ TransFx-H培地で凍結保存した細胞は、作成した細胞バンクから解凍しました（材料と方法を参照）。

細胞バンクの解凍と細胞増殖の比較

細胞は細胞バンク（材料と方法参照）から解凍し、播種し、週に2回継代培養しました。

Fig 3に、顕微鏡による細胞形態の評価を示します。ほとんどの細胞は生存しており、単細胞懸濁液の状態です。

Fig 3. HyCell™ TransFx-H培地で培養したHEK293T細胞の単細胞懸濁液。

個体群倍加時間（PDT）は平均で約20時間でした（Fig 4）。良好な細胞生存率（> 97%）は、10回の継代の間、維持されました（Fig 4）。

Fig 4. (A）HyCell™ TransFx-H培地で培養した細胞の個体数倍化時間を10継代にわたって調査。(B）10回の継代における細胞生存率。

AAVプロセス開発用プラスミドコンストラクト

AAVの作製に必要な遺伝子とDNA配列を含むプラスミドコンストラクトは、もともとNordic Biosite社から入手したもので、当社のプロセス開発で使用されたものです。

AAV作製のためのプラスミドの増幅は、プラスミドで細菌を形質転換することで行われます。その後、形質転換した細菌を培養すると、プラスミドDNAが複製されます。プラスミド精製キットを用いることで、採取した材料から大量のプラスミドDNAを回収することができます。

Design of Experiments (DoE)：HEK293T浮遊細胞を用いたrAAV生産プロトコルの最適化

トランスフェクションの最適条件を評価するために、一連のDoE試験を実施しました。全部で5つの研究が行われ、4つがrAAV2に適用されました。プロセス開発では、下流工程の要件を満たすために、以下の基準を達成することを目標にしました：10¹⁴個のウイルス粒子（VP）/L、10¹³個のウイルスゲノム（VG）/L、収穫物中のフルキャプシドが10％以上。DoEスタディ1-4により、rAAV2ではこれらの要件をすべて達成できないことが判明したため、開発したトランスフェクションプロトコルをrAAV5でテストしたところ、rAAV5の方が優れていることが判明しました。そこでDoE5は、rAAV5産生に最適なDNA濃度やDNA-PEI複合体のインキュベーション時間を確認する検証試験として企画されました。

DoE1

DoE1は、プラスミドDNA濃度、異なる細胞密度、PEI/DNA比、トランスフェクション量、インキュベーション時間について調査しました（Table 1）。異なる条件の効果を検証するために、トランスフェクション効率を調査しました。

Table 1. DoE1セットアップで使用するパラメータ

一過性のトランスフェクションでは、PEIがプラスミドDNAを凝縮してプラス電荷の粒子にし、それがアニオン性の細胞表面と相互作用して、PEI/DNA複合体がエンドサイトーシスにより細胞内に入ります。PEIとDNAの比率は、トランスフェクションの効率に重要な役割を果たします。MODDE™ Pro v12.0.1 ソフトウェア（Sartorius Stedim GmbH）を用いて、DoE 1のすべてのパラメータを評価しました。その結果、高いトランスフェクション効率を得るためにはどのようなパラメータを使用すべきかを予測することができました（Fig 5）。

Fig 5. トランスフェクション後72時間後に最適なトランスフェクション効率を得るためには、（A）トランスフェクション量は全容量の6％である必要があった。(B）トランスフェクションのインキュベーション時間を長くすると、トランスフェクション効率にマイナスの影響を与えた。

DoE2

DoE2では、DoE1の評価をもとに、以下のパラメータを設定しました。DoE2では、温度とDNAプラスミド比率を調査し、評価しました。

最適なDNA量は、トランスフェクションされたプラスミドの特性（プラスミドのサイズ、複製起点など）により異なります。さまざまな遺伝子の投与量も生産性に影響するため、pAAV-RC2 Vector (a), pHelper (b), pAAV-Vector-GFP (c) で異なる比率をテストしました。また、rAAV製造時の温度を34℃、35.5℃、37℃と変化させ、トランスフェクション効率への影響を評価しました。

Fig 6では、DoE1とDoE2の違いを丸印で表しています。

Fig 6. DoE2で評価したパラメータは、丸印で示したDoE1と比較して、HEK293T細胞へのトランスフェクション効率（GFP発現細胞の割合）の向上に相関しています。

AAVの感染性とその後のGFPの発現は、トランスダクションアッセイによって決定されました。溶解したサンプルをトランスダクションアッセイで定量し、フローサイトメトリーで評価したところ、トランスダクションした細胞はGFP陽性細胞を発現し、その結果から感染力価（TU/mL）を算出することができます。このことから、DNA比率の違いによって感染価が向上することがわかります。

トランスダクションアッセイに基づくDoE2での各種パラメータをFig 7に示す。丸印はDoE1とDoE2の間の改善度を示しています。

Fig 7. DoE2で評価された、HEK293T細胞での感染力価の向上に寄与するパラメータ。DoE1の条件を丸で囲んでいます。

DoE3

qPCRにより、ウイルスゲノムの力価を解析することができました。これは、プロセスをさらに最適化し、収穫物中のフルカプシドの割合を増加させるために重要なことでした。フルカプシドの割合は、qPCR による VG 力価のデータ（VG/L）と ELISA で検出されたカプシドタンパク質の量（capsids/mL）を比較することで推定されます。トランスフェクション効率は、ELISAおよびqPCRによって測定されるウイルス力価と低い相関を示すことが明らかとなりました。

VCDを1×10⁶/mLにすると、ウイルスゲノム力価が向上します。

DoE4

フルキャプシドの割合とVGは、下流の精製工程でフルキャプシドを効率的に分離するために最も重要な要素である。rAAV2精製プロセスを可能にするためには、収穫物中に少なくとも10%のフルカプシドが必要であった。そこで、rAAV2について別のDoE評価を実施し、今回はDNA濃度と収穫時間（ToH）が生産中のウイルスゲノム力価およびフルキャプシドの割合に及ぼす影響について調べました。

DNA 濃度を上げると VG 力価は高くなるが、フルキャプシドの割合に悪影響を及ぼすことがわかりました（Fig 8）。高い VG 力価を得ながら、同時に 10%以上のフルカプシドを得るには、0.75μg/mL の DNA 濃度が必要であることを見いだしました。

この条件下では、収穫時期はVG力価およびフルカプシドの割合に大きな影響を及ぼしません。

Fig 8. DoE4で評価したパラメータでは、DNA濃度を上げると（A）VGタイターが高くなるが、フルカプシドの割合（B）はマイナスの影響を受けることがわかった。

rAAV2のDoE1-4の実験をまとめると、VG力価やフルキャプシドの割合の検討から、時間の経過とともに進歩していることがわかります（Fig 9）。しかし、フルキャプシドの割合に関する我々の基準は満たされておらず、AAV2はフルキャプシドの最適化が困難であることが一般に認められています。そこで、もう一つの臨床的に重要な血清型であるAAV5について、同定された条件をテストすることにしました。

Fig 9. A）VG力価、（B）フルカプシドの割合のDoEスタディに基づく経時的な進展。

DoE5

AAV2トランスフェクションプロトコルがAAV5作製に使用できることを検証しました。2つのパラメータが重要でした。DNA濃度とトランスフェクションのインキュベーション時間です。その結果、DoE4 で得られた知見を確認した：DNA 濃度を上げると VG 力価は高くなり、フルカプシドの割合は低くなり、トランスフェクション時間は VG 応答にほとんど影響しません（Fig.10）。

Fig 10. (A). DNA 濃度を上げると、VG 力価は高くなる。トランスフェクションのインキュベーション時間は、VGの反応に大きな影響を与えない。(B). DNA濃度を上げると、フルカプシドの割合が低くなる。低濃度のDNAを使用した場合、トランスフェクションのインキュベーション時間がよりフルカプシドの割合に影響を与える。

DoEでデザイン空間最適化モデルを行い、10%のフルキャプシドまたは15%のフルキャプシドを得る確率を評価しました。フルカプシドの割合が高いほど、トランスフェクションパラメータを選択する領域が小さくなります(Fig 11)。

Fig 11.デザイン空間最適化により、（A）10%フルキャプシド、（B）15%フルキャプシド（緑色の部分）の達成確率を調査。

DoE実験では、高濃度のDNAがVG力価を向上させ、トランスフェクションのインキュベーション時間はVG力価に大きな影響を与えないことがわかりました。しかし、フルカプシドの割合を見ると、DNA 濃度を下げ、インキュベーション時間を短くすることで、フルカプシドの割合が増加するという逆の効果が見られました。

まとめると、DoE5試験におけるrAAV5産生の検証では、トランスフェクションのインキュベーション時間の短縮がフルキャプシドの割合に正の影響を与えることが示されました。DoE実験での反応から、トランスフェクションの間、0.75 µg/mLのDNA濃度と15分のインキュベーション時間は、テストした条件下で最適であると思われると結論づけられました。

トランスフェクションの最適化されたプロトコール

最終的なトランスフェクションプロトコルとパラメータを以下のTable 2に示します：

Table 2. トランスフェクションプロトコルに使用した最終パラメータ

トランスフェクションのインキュベーション時間が15分のrAAV5製造プロトコルを確認するため、ReadyToProcess WAVE™ 25バイオリアクターで10Lの製造を実施しました。このバイオリアクターでの生産は、下流工程でさらに精製するためのすべての受け入れ基準を満たしました。

まとめと考察

HEK293T細胞をHyClone™培地での無血清浮遊培養に適合させました。細胞は新しい培地に直接移植することにより、短時間で効率的に馴化されました。細胞の生存率は非常に高く、ほとんどの細胞が単細胞懸濁液の状態でした。細胞はHyCell™ TransFx-H培地中で急速に増殖し、集団倍加時間は約20時間でした。

馴化の過程で、凝集を誘発する可能性があるため、非常に高い細胞密度を避けることが重要であることがわかりました。一般に、2.5×10⁶cells/mL以下に抑えました。細胞の凝集は、トランスフェクション効率を低下させ、生産のスケールアップに支障をきたす可能性があります。重要なことは、HEK293細胞もHyCell™ TransFx-H培地に馴化し、同様の性能で培養できることを確認したことです。AAVの生産にHEK293T細胞を使用することは、SV40ラージT抗原の存在により規制上の受け入れが議論されており、多くの場合、HEK293細胞が好まれるようになっています。

ReadyToProcess WAVE™ 25でrAAV5材料の生産をスケールアップし、スケーラブルで堅牢なプロセスで高いウイルス力価と高い割合のフルキャプシドの両方を生成しました。rAAV2トランスフェクションプロトコルの検証を行い、プラスミド精製の最適な基準を達成するためにrAAV5を製造しました。

この条件でrAAV5収穫物の基準をすべて満たしました。

したがって、本研究で説明した最適化されたトランスフェクションプロトコルは、いくつかのAAV血清型に適しており、臨床グレードのAAVベクターの生産に必要な量にスケールアップできると考えています。この研究では、AAV 2と5に対する最適化を説明しましたが、この戦略はAAV 8と9にもうまく使用されています（現在進行中）。