March 18, 2021
PCR試薬の選択：何を、なぜ、どれを？
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PCR成功のカギは、使用するアプローチ、デザイン、試薬、機器の適切な選択にかかっています。ここでは、試薬の選択肢とその課題についてのクイックガイドをご紹介します。
核酸増幅検査（NAAT）の進歩にもかかわらず、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、核酸を扱うすべての研究室の中心的存在となっています。PCRは、基礎研究から応用研究まで、RNAやDNAの同定、配列決定、修飾などに役立っています。
しかし、このように確立された方法でも、うまくいかないことがあります。PCRでは、非特異的な偽陽性、異なる遺伝子変異を持つ異質な産物、そして時には産物がまったく出ないこともあります。このような問題を最小限に抑えるには、どうすればよいのでしょうか？
このチャートでは、各試薬の役割、課題、そしてPCRを成功させるための選択肢を理解することができます。
Reagents for PCR
| Reagent |
Function |
Challenges |
Solutions |
|
Primers |
Bind to specific sequences of denatured DNA flanking target DNA. Bind in a 5’ to 3’ and 3’ to 5’ direction. |
• Self-anneal • Primer-dimer formation • Different Tm values • Non-specific DNA amplification in RNA analysis |
• Use software or online tools to aid design • Re-design primers with: • low GC content • fewer nucleotide repeats • similar Tm values • Design primers across intron-exon boundaries or exon-exon junctions |
|
Probes |
Bind to denatured DNA in a target-specific manner and are fluorescently labelled (used in qPCR). | • Non-specific binding • No binding • No fluorescence • Bleeding of dyes in multiplex reaction |
• Re-design probes with: • low GC content • higher Tm (6-8oC) to primers • Choose different type of probe • Chose fluorescent detection markers that have separate emission properties |
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DNA polymerase |
Catalyzes the synthesis of DNA from dNTPs. | • Low fidelity-lacks 3’ to 5’ exonuclease or ‘proofreading’ activity • Generation of partial products |
• Choose high-fidelity enzyme • Use ‘hot start’ enzyme to avoid activation at sub-optimal temperatures • Optimize elongation temperatures |
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Buffer |
Provide a stable chemical environment for DNA polymerase activity. | • Reduced DNA polymerase activity | • Optimize the pH for specific DNA polymerase • Add individual ions to alter pH, e.g., Mg2+ |
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dNTPs |
Provide the building blocks for DNA synthesis. | • PCR inhibition | • Optimize concentration of dNTPs – excessive dNTPs can lead to inhibition |
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Additives |
Increase yield, specificity, and consistency of PCR. | • Secondary structures created by high GC content • PCR inhibition |
• Addition of enhancers can help with challenging PCR conditions • Replacing dGTP with 7-deaza dGTP, adding DMSO or formamide will reduce secondary structures • Addition of BSA can overcome PCR inhibition |
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