タンパク質作製の開始から終了までを理解する

タンパク質研究では、研究のアイディア段階からキャラクタライズされた高純度なタンパク質を入手するまでには、さまざまな技術と多くのステップを必要とします。この過程を効率化することで、結果を迅速に入手し、期限内に結果を公表することができ、プロジェクトに関する極めて重要な決定も可能となります。

タンパク質の検索や特定の標的生体分子の開発を行っている研究者のほとんどは、細胞培養、サンプル調製、精製および解析を含む複数のステップを使用しています。そのためにはさまざまなツールの原理を理解し、技術の習得に時間をかける必要があるため、データの作成や研究の進行に利用できる時間を犠牲にすることもあると思います。時間的余裕がない状況では、タンパク質の開発および作製の完全なワークフロー戦略を設定することはとても困難に思えるかもしれません。

Jon Lundqvist、Jinyu Zou、Anna Mobergは、20年以上にわたるタンパク質研究の経験を有するCytiva研究者です。本稿では、タンパク質研究の迅速な進展に役立つ専門的な助言、知見およびヒントをお届けします。

タンパク質の作製および精製のワークフロー

長年にわたり、技術の進歩によってタンパク質研究ワークフローのステップの簡略化および利便性の改善が続けられてきた結果、一人の研究者がワークフロー全体またはその大部分をカバーすることが可能となっています。これは総じて好ましいことではありますが、研究者が細胞培養、タンパク質精製およびタンパク質特性化などの方法を学ぶ機会が減ってきているということも意味しています。

タンパク質作製のための指針として、Jon、JinyuおよびAnnaがそれぞれの専門知識を集結させ、お客さまの研究を加速させ次の論文やプレゼンテーションに備えることを可能にする知見をご提供します。

タンパク質研究のステップ：細胞培養、サンプル調製、精製および解析

プロトコールを設定する前に、最終的な目標および各ステップの目的を設定します。その際、下記について考慮してください。

  • 研究の目的は何か。精製したタンパク質をどのように使用するのか（例えば、構造および機能の同定、治療または診断への使用）。
  • 標的タンパク質の同定および機能に関してどの程度の情報を有しているか。
  • どのような分析方法を使用するのか。
  • タンパク質の機能性に、糖鎖付加などの翻訳後修飾（PTM）が必要か。それが発現系に影響を与えるか。

明確な目標は、使用する発現系、目的とする純度と収率、複数の分析を実施するために必要なサンプルの量と質の決定に役立ちます。目標を設定することは、使用する解析方法の選択にも役立ちます。

機器や消耗品の選択では、より綿密な調査を行います。タンパク質が異なれば特性も異なるため、同一のプロトコールや既存の機器を再利用しても、望ましい結果が得られない可能性があります。研究分野の文献を検索し、多くの人に意見を求めさらに理解を深めましょう。研究室の規模によっては、同僚から豊富な情報を得ることも可能です。学会、会議、ウェビナーなどは他の科学者から学ぶ絶好の機会です。お客さまのアプリケーションに容易に利用または応用できる方法をベンダーから入手することも可能です。

Steps in protein research: cell culture, sample prep, purification, and analysis.

サンプル調製

サンプル調製、タンパク質精製および分析を通して、タンパク質の損傷を避け、タンパク質の活性を維持する必要があります。

タンパク質の感受性はそれぞれ異なります。タンパク質を理解することで、使用する条件および回避すべき条件を区別することができます。タンパク質の中には、分泌タンパク質のように発現レベルの低いものがあり、発現レベルが低い場合には、各ステップにおいて高収率を維持することがさらに重要となります。

サンプル調製はタンパク質の種類により異なります。膜タンパク質、タンパク質複合体および分泌タンパク質ではサンプル調製プロトコールがそれぞれ異なります。細胞内タンパク質の場合、標的を放出するために、超音波処理、均質化、凍結融解、または化学物質によって細胞を溶解します。

哺乳類または昆虫細胞で得られた細胞外タンパク質では、細胞を直接採取することができます。細胞の採取には多くの場合、遠心分離が使用されます。ほとんどのアプリケーションでは、標的タンパク質を含むタンパク質精製物に上清を移す、または直接分析して同定および活性測定を行います。

必要に応じて、遠心後、またはクロマトグラフィー前にカラムを保護するために、ろ過により粒子を除去することもできます。研究室スケールでの脱塩は、低分子量の不純物を除去し、1回のステップでサンプルを必要なバッファーに移すことのできる、十分に証明された、簡単で迅速な方法です。

脱塩またはバッファー交換は、クロマトグラフィーの前、または精製ステップの間でのサンプルコンディショニングのために使用できます。

タンパク質精製

タンパク質研究では多くの場合、2種類の精製ステップ、すなわちアフィニティークロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーが使用されます。高純度が必要な場合は、イオン交換クロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーの中間工程を追加します。ただし、ステップを追加すると全体的なタンパク質収率が低下するため、可能な限り少ないステップを使用するようにしましょう。

Combine chromatography techniques to optimize your protein purification protocol.

タグ付き組換えタンパク質は通常、精製が容易です。使用するタグシステムに適したアフィニティー樹脂を使用し、タンパク質の自然条件を使用して沈殿や分解を回避します。

精製後にタグの除去が必要な場合もあります。タグ切断後、タグを含まない標的タンパク質を、タグおよびタグを含む標的タンパク質から分離する必要があります。カラム上での切断を使用することも可能です。その場合、標的タンパク質が結合したカラムにプロテアーゼを添加することで、1ステップで切断および除去が行えます。

抗体精製には多くの場合アフィニティークロマトグラフィーが使用されます。アフィニティークロマトグラフィーでは、多くの動物種のIgGのFc領域に対するプロテインAおよびプロテインGの高い親和性と特異性を利用します。κ軽鎖に結合するプロテインLも、抗体フラグメント、IgGおよび幅広い真核生物種のその他の抗体を精製するためのリガンドとして使用できます。より高い純度が必要な場合には、2番目のステップとしてSECがしばしば使用されます。

タグ付きでないタンパク質のプロトコールの開発は、やや困難です。実験計画を作成することで、望ましい純度および収率を達成するために試験するべき条件および最適化するべき因子を同定できます。

アフィニティーステップには自然落下式カラムが一般的に使用され、他のクロマトグラフィーステップにはペリスタルティックポンプが使用される場合もあります。タンパク質精製システムは、多くの場合プレパックカラムと共に使用することで、制御を著しく向上させ、標的タンパク質および不純物に関するより詳細で一貫性のある情報の入手を可能にします。さらに、カラムの保護も向上します。

タンパク質解析 – 同定および特性化

タンパク質のサイズ、構造および生化学的性質は多様です。単離したタンパク質の特性化には、これらの違いを利用します。タンパク質の発現、作製、中間工程および精製タンパク質に関して、同定および結合活性の確認に、複数の技術を使用することができます。

多くの技術および方法は、解析および特性化に一般的に使用されています。UV、SDS-PAGEおよびSECは、標的タンパク質を含有する画分の特定に広く使用されています。酵素アッセイのような特定のタンパク質のアッセイも使用されていますが、標的タンパク質に特異的な基質が必要です。

精製後に、構造、結合活性、安定性などを決定することができます。それらの決定には多くの場合、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）カラムと質量分析の組み合わせ、アミノ酸配列解析、X線結晶解析、低温電子顕微鏡法（cryo-EM）、表面プラズモン共鳴（SPR）、ウェスタンブロット、円偏光二色性分析および核磁気共鳴（NMR）分光法が使用されます。

ウェスタンブロッティング

ウェスタンブロッティングは、タンパク質の定量および同定のための、最も確立された一般的な手法の一つです。この方法では抗体とタンパク質の複合体を構築させます。つまり、膜固定化タンパク質に抗体を結合させ、化学発光や蛍光などの検出法を用いて結合抗体を検出します。細胞や組織抽出物のような複合タンパク質混合物も、精製操作からの分画など、精製タンパク質のサンプルもサンプルとして使用できます。

ウェスタンブロットのワークフローには、解析前にいくつかのステップが含まれます。

The Western blot workflow has several steps before analysis.

タンパク質分離用サンプルのゲル電気泳動後、電気的トランスファーによりタンパク質をメンブレン（ニトロセルロースやPVDFなど）に固定します。

次に、標的タンパク質に特異的に結合する一次抗体と共にメンブレンをインキュベートし、未結合抗体を洗浄除去した後、酵素、蛍光色素、または放射性物質を結合させた検出用の二次抗体を結合させます。タンパク質に一次抗体および二次抗体が結合した複合体から検出されたシグナルは、メンブレン上のタンパク質の量に比例します。

従来の全タンパク質染色法ではダイナミックレンジが制限されることが多く、銀染色やクマシー染色では通常、1桁または2桁狭くなります。これとは対照的に、蛍光色素および化学発光による検出は、検出ウィンドウが非常に広く、迅速で使用が容易なうえに高感度です。

化学発光および蛍光範囲のブロットはいずれも、CCDイメージャーを使用して高感度および高解像度で可視化できます。

SPRを用いた作用機序の同定

U分子間相互作用の機序の理解は、ライフサイエンスのあらゆる領域において極めて重要です。標識を使用しない相互作用分析により、豊富な内容を含むデータが作成され、ほぼすべての種類の生体関連分子間の相互作用に関する理解を深めることができます。

  • 相互作用可能な物質が互いに結合するか。
  • 相互作用はどの程度特異的か。
  • 結合の強さ（すなわち親和性）はどれくらいか。
  • 結合の速さはどれくらいか。
  • 温度は影響するか。
  • サンプル中に存在する相互作用物質の量はどれくらいか。
Biacore™ systems enable real-time analysis of events that are driven and regulated through dynamic interactions between key molecules.

生物学的プロセスは、重要な分子間の動的な相互作用によって引き起こされ制御される、リアルタイムの事象です。ELISAのようなエンドポイント法により提供される単なるスナップショットからは、全般的な結合強度などの基本的な情報しか得られません。親和性はオンとオフの速度に依存するため、親和性が同一の相互作用でも非常に異なるカイネティクスを有する可能性があります。Biacore™システムは、これらの極めて重要な違いの識別に必要なデータを提供できる、リアルタイムでの分析を可能にします。

Sensorgrams from Biacore™ SPR instruments showing three molecules with identical affinities, but kinetic profiles differing by several orders of magnitude.

親和性は同一でもカイネティクスプロファイルが数桁異なる3つの分子のセンサーグラムが示してあります。これらの差は、エンドポイント解析では検出できません。

Biacore™センサーチップは幅広い種類の相互作用物質の解析をサポートします。キットおよび既成の消耗品を使用することで、時間を節約すると同時に、抗体や共通のタグなどの分子の一貫性のあるキャプチャーが行えます。

Biacore™の初期設定の測定法をアプリケーションに適した設定で使用することを推奨します。評価ソフトウェアと組み合わせて使用することで、優れたデータ概要が得られ、結果までの時間を短縮できます。

ガイダンスとヒント

プロトコールには汎用的なアプローチを使用したいと思われるかもしれませんが、長期的にはそれが時間のロスにつながります。特定のタンパク質に適合させるためにプロトコールを調整し、特定の標的用にステップを加えたり、変化させたり除去したりする必要が生じます。汎用的なプロトコールを使用するという考えは、低発現、低収率および時間のかかるトラブルシューティングにつながる可能性があります。

研究を早く開始したいという熱心な思いが先立ち、文献の検索および計画の作成に十分な時間が費やされないという場合が多いかもしれません。はじめのうちは速く進むかもしれませんが、最適でないプロトコールにより最終的には結果への到達が遅れてしまいます。はっきりとした最終目標、各ステップの明確な目的および徹底した計画作成は、より良い結果をより早く得るために有用です。


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