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Location:Home実験手法別製品・技術情報ウェスタンブロッティング

ウェスタンブロッティングとは

ウェスタンブロッティングは、電気泳動の優れた分離能と抗原抗体反応の高い特異性を組み合わせて、タンパク質混合物から特定のタンパク質を検出する方法です。

タンパク質を電気泳動により分離した後、メンブレンに転写・固定化してブロットを作製します。続いてブロットを目的タンパク質に対する抗体(一次抗体)に反応させます。Horse Radish Peroxidase(HRP)やAlkaline Phosphatase(AP)などの酵素で標識した二次抗体を一次抗体に反応させて、発光や蛍光を発する基質を加えて検出します。ぞれぞれの利点として、化学発光(ECL)は高感度なので微量タンパク質が検出できる点、化学蛍光(ECF)では定量性の高い検出ができる点が挙げられます。

ウェスタンブロッティングは、ライフサイエンスのさまざまな分野で、特定のタンパク質(群)の検出や解析のためのスタンダードな手法として用いられています。

【日本語・無料ウェビナー】

【基礎編】ウェスタンブロッティングの基礎からトラブルシューティングまで
日時:2020年8月26日 15:00~15:30 ※ライブ配信後は、オンデマンドもあります!
ぜひこちらからご登録ください。お申し込みは、こちら>>

【実践編】ウェスタンブロッティングの基礎からトラブルシューティングまで
日時:2020年9月2日 15:00~15:30 ※ライブ配信後は、オンデマンドもあります!
ぜひこちらからご登録ください。お申し込みは、こちら>>

初心者編

ウェスタンブロッティングガイド、知識から学ぶ

ウェスタンブロッティングのワークフローには、主に次の5つの基本ステップが含まれます。

Step1.サンプル調製:細胞もしくは組織からタンパク質サンプルを抽出
Step2.電気泳動分離:SDS-PAGEを用いて、異なる分子量のタンパク質を分離
Step3.転写:タンパク質をPVDFまたは、NCメンブレンに転写
Step4.抗体反応:目的タンパク質に対する抗体(一次抗体)に反応および、標識した二次抗体を一次抗体に反応させる
Step5.タンパク質検出:化学発光検出試薬を用いて目的タンパク質を検出

転写
Step1.サンプル調製 Step2.電気泳動分離 Step3.転写 Step4.抗体反応 Step5.タンパク質検出

ウェスタンブロッティングの実験の流れをもっと知りたい方は
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ウェスタンブロッティングのトラブルシューティング

弊社アンケートでウェスタンブロッティングをやっている方に「現在トラブルや改善したいポイントがありますか」とお伺いしたところ、数多くの方がお悩みを抱えてらっしゃることが判明しました。そこで、トラブルが多かった

1.非特異的なバンドが現れる
2.シグナルが検出できない
3.バックグラウンドが高い

の原因と解決法をご紹介します。

この場合、まずはサンプルの添加量や抗体濃度を減らしてみてください。抗体濃度の最適化はドットブロットで行います。また、ECLなどHRP酵素系での検出の場合、サンプルの内在性ペルオキシダーゼに検出試薬が反応してしまい非特異的なバンドが生じることがあります。

ウェスタンブロッティングで「目的タンパク質以外の非特異的なバンドが検出される」場合の対処法の詳細は、 こちら』を確認ください。

この場合、ウェスタンブロッティングのさまざまなステップに原因がある可能性があります。まず、転写に原因があるかどうか判断する場合は、有色マーカーを使用してゲルからメンブレンへの転写効率を確認することが効果的です。

セッティングに問題がない場合は、ブロッティング時の電圧の状態、転写条件(転写バッファー、転写時間など)の検討が必要となります。

メタノールやSDS濃度を検討しても、十分な結果が得られなかった場合、 メンブレンとゲルを挟む上下のろ紙に含ませるバッファーのpHや塩濃度に変化をつける不連続バッファー系によっても転写が改善することがあります。

ウェスタンブロッティングで「シグナルが現れない」場合の対処法の詳細は、 こちら』を確認ください。

バックグラウンドの問題もウェスタンブロッティングの各段階において原因が潜んでいます。

原因その1:「装置・器具・試薬からのコンタミネーション」、具体的にはブロッティング装置、メンブレンの振とうに使う容器、メンブレンを掴むピンセットなどがあります。
原因その2:「抗体濃度」、検出に最適な抗体濃度はサンプル、抗体の種類、そして検出試薬によって異なりますので、抗体濃度の最適化を十分に検討します。
原因その3:「ブロッキング・洗浄が不十分である」、ブロッキングと洗浄のそれぞれの操作については、使用する溶液組成や処理時間・回数を検討することで、バックグラウンドが改善する可能性があります。

ウェスタンブロッティングで「バックグラウンドシグナルが高い」場合における対処法の対処法の詳細は、 こちら』を確認ください。

「非特異バンドが現れる」、「シグナルが検出できない」、「バックグラウンドが高い」以外のトラブルシューティングは、下記の回答をご参照ください。

バンドが出ない S/N比をあげたい 条件設定(転写効率) 条件設定(抗体) ノイズ、ムラ 時間短縮 サンプル調製
定量性を高める 再現性 条件設定(ブロッキング) リプロービング

経験者編

ウェスタンブロッティングガイド、知識から学ぶ

ウェスタンブロッティングのトラブルシューティング技能を向上した上で、これまでよりももっと、一歩先ゆく分析データを求めたい方は、下記の最良なウェスタンブロッティングのためのポイントをご覧ください。

転写や抗体反応など実験ステップ数が多く、定量性を保つことが難しい技術といえます。各ステップ(泳動、転写、抗体反応、検出)ごとでの細かい操作や注意を払うことで、より定量性を保った状態で検出が可能です。

定量性を保つための基本的な操作ステップとポイントの詳細は、 こちら』を確認ください。

タンパク質検出プロトコールを大幅に時間短縮することができます。

ウェスタンブロッティング操作時間をできるだけ短くしたい方は、ぜひ以下のガイドを参考に操作を行ってください。

タンパク質検出の実験ガイドの詳細は、 こちら』を確認ください。

貴重なサンプルを扱っている場合や、どうしても同サンプルから複数タンパク質の発現比較(ウェスタンブロッティングのマルチプレックス化)を行いたい場合などには、一度抗体反応(検出)を行ったメンブレンを再利用する手法がとられます。

化学発光検出における手順を2パターンに分けて紹介すると共に、最後に蛍光ウェスタンブロッティングについて触れさせていただきます。

また、エレクトロブロッティング装置種類、メンブレンおよび、検出に用いる抗体の選択ポイントは、 こちら』を確認ください。

ウェスタンブロッティングをもっと知りたい

動画コンテンツ

読み物コンテンツ

ウェスタンブロッティング 攻略ガイド

ウェスタンブロッティングの教科書として、たくさんのお客さまからご請求いただきました。トラブルシューティングをもっと詳しくしたい方は、ぜひお申し込みください。

お申し込みはこちらから

ウェスタン画像撮影装置編

ウェスタンブロッティングをもっと快適にしませんか?

新発売のウェスタンブロッティング画像解析装置「Amersham ImageQuant 800」は、みなさんが画像解析であきらめてしまっているかもしれない、こんなお悩みごとを解決します!

高感度/高解像度のカメラで微弱な近接バンドの解析が可能

近接するバンドがうまく判別できずお困りではないでしょうか?

8.3メガピクセルの新しい高解像度カメラ(F 0.74)により、近接したバンドの解析を容易にします。下記のイメージは、0.5 mmしか離れていないバンドを判別している例です。

Tips:リン酸化解析で活躍

特にリン酸化のウェスタンブロッティングによる検出は、リン酸化によってバンドがシフトすることを利用して、リン酸化/非リン酸化の割合を解析できる利点があります。

ただし、シフトしたバンドは近接するため、カメラの解像度が重要になります。またリン酸化/非リン酸化の割合が大きく異なる場合、近接している濃いバンドに薄いバンドが隠されてしまうことがあるため、ダイナミックレンジの広いイメージングが重要となります。

近年新しく開発された試薬(Phos-tag)では、この近接するバンドシフトを大きくすることで、リン酸化の検出・解析をさらに容易に行うことができるアプリケーションも存在します。

Conventional ウェスタンブロッティング(左)とPhos-tag(右)によるリン酸化バンドの検出

参考文献;Ogawa T, Hirokawa N. Microtubule Destabilizer KIF2A Undergoes Distinct Site-Specific Phosphorylation Cascades that Differentially Affect Neuronal Morphogenesis. Cell Rep. 2015; 12(11):1774-88

詳細はアプリケーションノートでご紹介しています。
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SNOW検出モード

インクリメントでの撮影時に、薄いバンドを検出しようとすると濃いバンドが飽和してしまう、そんなお悩みはありませんか?

新しく加わったSNOW検出イメージングモードを使えば、濃いバンドを飽和させずに、より薄いバンドの検出が可能となるため、ダイナミックレンジの広い高感度イメージングを実現します。

  • 従来機種に比べ2倍以上の高感度
  • シグナルを飽和させずノイズを低減し、より広いダイナミックレンジでの画像取得が可能

露光時間の最適化などの条件設定を行う必要がなく、ベストな画像が取れた時点で自動的に撮影が終了します。

Tips:SNOW検出モードもっと詳しく

SNOW(Signal Noise Optimization Watch)検出モードの正体は、科学の世界において非常によく知られたテクニックである「平均(加 算平均)」です。加算平均は分光学や天文学などの分野では誰もが知るところですが、ウェスタンブロッティングの世界では初めて採 用されました。

SNOW 検出モードでは、同じ方法で何回も繰り返し撮影して得た画像を平均することで、S/N 比(シグナル/ノイズ比)を改善します。 その結果、画像中のノイズを低減して、狙ったバンドがはっきりと見えるようになります。

ノイズってなに?

デジタル画像のノイズは、センサーや電子回路によって生じます。ノイズの輝度(Intensity)はランダムなため、同じ条件で撮影しても異なっ たノイズのパターンが得られます。ノイズの輝度は上下にばらつくので、撮影した複数の画像を平均していくことで相殺し、ノイズを低 減することができます。

SNOW検出モードの流れ

  1. 画像を繰り返し撮影する
  2. それらの画像を平均していく
  3. S/N 比が改善されなくなるまで繰り返す
  4. きれいなイメージをらくらくゲット!

詳露光時間や撮影の設定をあれこれ工夫することなく、SNOW 検出モードを使っていままでよりもっと簡単にきれいな画像を手に入れましょう。

化学発光と蛍光の組み合わせで、蛍光ウェスタンをもっと活用

複数ターゲットを同時検出しようとする際に蛍光ウェスタンの感度が不足していてお困りではないでしょうか?Amersham ImageQuant 800 では、一度の設定で化学発光と蛍光の画像を連続して撮影することができます。たとえばハウスキーピングのタンパク質バンドを蛍光検出し、ターゲットのタンパク質バンドを化学発光検出した後に、簡単に画像をマージすることができます。この手法を用いることで、蛍光ウェスタンブロッティングの感度不足を補い、複数ターゲットの同時検出が容易になります。また、Amersham QuickStainを用いたトータルプロテインノーマライゼーションも可能です。

Tips:ウェスタンブロッティングのトータルプロテインノーマライズ

ノーマライズを行う場合、従来、内部標準タンパク質(アクチン、GAPDH等)を用いることが一般的でしたが、近年ではトータルプロテインも使用されています(トータルプロテインノーマライズ)。この方法では下記に示すように、実験条件によるタンパク質発現量のばらつきが内部標準タンパク質を用いた場合に比べ小さい(CV:~10%)ため、より定量性の高いデータを得ることができます。CHO細胞ライセートからERK1 / 2を検出し、定量した結果の例を示しました。

SNOW 検出モードでは、同じ方法で何回も繰り返し撮影して得た画像を平均することで、S/N 比(シグナル/ノイズ比)を改善します。 その結果、画像中のノイズを低減して、狙ったバンドがはっきりと見えるようになります。

Cy5で標識したトータルプロテイン*でノーマライズした定量結果(左)
βチューブりんによるノーマライズした定量結果(右)
※Cy5でトータルプロテインを標識する試薬としてAmersham QuickStain があります。

Loading control Variantion of normalized ratio between
2.5 to 20 μg sample load (CV %)
Cy5 Total protein 7
Tubulin 18
Actin 14
GAPDH 53

ERK1 / 2を異なるノーマライズプロテインを用いて定量したときの定量値のばらつき(CV%)
参考文献: Åsa Hagner-McWhirter, et al , “Cy5 total protein normalization in Western blot analysis”, Analytical Biochemistry 486 (2015) 54–61

励起光源とフィルターの自由な組合せで、幅広い蛍光色素が利用可能

蛍光ウェスタンを使った複数ターゲットの同時検出や多重染色をもっと簡単にしてみませんか?

Amersham ImageQuant 800 では、励起光源とフィルターの組合せを自由に設定することができます。たとえば、励起光源と通常とは異なる波長のフィルターで検出するような色素も使用できるので、より幅広い選択肢の中から蛍光色素を選ぶことができます。蛍光標識二次抗体の Amersham ECL Plex と組み合せて使用することで、さらに簡単に複数ターゲットの同時検出が可能になります。

6 種類の励起用 LED とフィルターを装備し、化学発光に加えて広範囲のアプリケーションに対応します。励起光源には、従来の白色落射光(カラーマーカー撮影等)、白色透過光(デンシトメーター等)、UV(DNA 染色等)、RGB(蛍光ウェスタンブロット等)に加えて、IR-short、IR-long が追加されました(RGB、IR-short および IR-long は、最上位機種 Fluor モデルのみ)。

蛍光ウェスタンで同時に複数のタンパク質を検出したい方へ

蛍光標識二次抗体をお探しの方へ

  • 複数の目的タンパク質の同時検出
  • 広いダイナミックレンジ、高い直線性による優れた定量性
  • 抗体除去・リプロービングが不要ーサンプルのロスを防ぎ、実験の手間を削減
  • 安定した蛍光持続時間によりくり返し検出が可能
  • 簡便なプロトコール
  • ご注文情報

    Amersham ECL Plex

    製品名 包装 コード番号
    ECL Plex goat-α-mouse IgG-Cy5 150 μg PA45009
    ECL Plex goat-α-rabbit IgG-Cy5 150 μg PA45011
    ECL Plex goat-α-mouse IgG-Cy3 150 μg PA43009
    ECL Plex goat-α-rabbit IgG-Cy3 150 μg 28901106
    ECL Plex Fluorescent Rainbow Markers 500 μg RPN851E
    ECL Plex Fluorescent Rainbow Markers 120 μg RPN850E

    Amersham CyDye NIR secondary antibodies

    製品名 包装 コード番号 製品名 包装 コード番号
    Amersham CyDye 700 goat-anti-mouse 0.1 mg 29360784 Amersham CyDye 800 goat-anti-mouse 0.1 mg 29360788
    Amersham CyDye 700 goat-anti-mouse 0.5 mg 29360785 Amersham CyDye 800 goat-anti-mouse 0.5 mg 29360789
    Amersham CyDye 700 goat-anti-rabbit 0.1 mg 29360786 Amersham CyDye 800 goat-anti-rabbit 0.1 mg 29360790
    Amersham CyDye 700 goat-anti-rabbit 0.5 mg 29360787 Amersham CyDye 800 goat-anti-rabbit 0.5 mg 29360791

    :医薬用外毒物(毒物及び劇物取締法にもとづく)です。

セミオート機能で、狙ったバンドの撮影に最適な条件をラクラク計算

自分が見たいバンドに最適な露光時間を検討するのに、手間がかかっていてお困りではないでしょうか?

Amersham Imagerシリーズに引き続き搭載されたセミオート機能を使えば、従来とは異なりインクリメントで撮影した画像から最適な露光時間を検討する作業が必要ありません。セミオート撮影機能では、プレ撮影した画像から注目するバンドを選択すると、そのバンドを検出するための最適な露光時間が自動計算されます。


Amersham ImageQuant 800で、いままでよりもっと簡単にきれいな画像を撮影しましょう!

 

近接した濃いバンドと薄いバンドを、両方ともきれいに検出するコツとは?

画像撮影時のバンドの飽和でもう悩まない。SNOW検出モードが解決します!
技術スタッフが動画で解説(日本語)

Amersham ImageQuantも掲載!

ウェスタンブロッティング画像解析装置・試薬ガイド

Download here

ImageQuant LAS 500

最小限に抑えた機能と価格で、導入しやすいイメージャーをお探しの方に。

More Details

試薬選択編

Amersham ECL

Cytiva(サイティバ)は、世界で初めて化学発光試薬であるECLを開発しました。30年以上経った現在でも広く使用され、ユーザーから高い信頼を得ています。

Amersham ECL は1990年に誕生し、業界で最も初期の化学発光試薬ブランドです。今日までにECLルーチンのタンパク質検出(Amershame ECL、Amershame ECL Start、Amershame ECL Prime、Amershame ECL Select)から蛍光Amersham ECL Plxに基づくマルチチャネル分析に至るまでのアプリケーションに対応するために試薬シーリズは、継続的に強化されてきました。

ECLシリーズの化学発光の原理と特徴

発光とは、励起状態にある基質が基底状態に戻る際に光を放出する現象またはその光を指します。化学発光は、化学反応により生じたエネルギーが光に変換されて起こります。ECL(Enhanced ChemiLuminescence)反応は、フェノール環を持つ化合物などエンハンサーの存在下でHRP(Horseradish peroxidase)によってルミノールが酸化されることで発光します。

Amersham ECLシリーズの使い分け

*製品サンプルをご用意しております。各製品ページのボタンよりお申込みいただけます。

ECLシリーズを使ったウェスタンブロッティングの結果およびご感想

お客様A:これまでと操作が同じな上、specificityや感度が高くかつ消光が少ないので扱いやすいです。
お客様B:ECL primeで15pg以下の蛋白質を問題なく検出しています。
お客様C:ECL Primeから混合比が1:1になり使いやすいと感じていたが、Selectはさらに感度がかなり良いことが今回の比較からわかった。バックも高くならず、画像もきれいだと思う。

Amersham ECLシリーズ:ウェスタンブロッティング検出試薬選択ガイド

 ECL感度比較(目安) 

 化学発光で結果を出したい方へ 

ECL Select ECL Prime ECL ECL start
推奨アプリケーション 最高感度の化学発光検出
  • ターゲットタンパク質や一時抗体の量が少ない場合に
高感度な化学発光検出
  • 発行安定性が高いため多検体処理も余裕をもって実験可能
一般的な化学発光検出
  • 過剰発現タンパク質検出
  • タグ付きタンパク質検出
一般的な化学発光検出
  • 高発現タンパク質検出
  • タグ付きタンパク質検出
感度*1 ECL Primeに対して2~8倍高感度 ECLに対して40~100倍の感度 ピコグラムオーダーのタンパク質を検出可能 ECLと同等
一次抗体希釈率の目安 1:5,000 ~ 1:30,000*2 1:1,000 ~ 1:30,000*2 1:500 ~ 1:5,000*2 1:500 ~ 1:3,000*2
二次抗体希釈率の目安 1:100,000 ~ 1:300,000*2 1:50,000 ~ 1:250,000*2 1:2,500 ~ 1:15,000*2 1:5,000 ~ 1:50,000*2
ブロッキング剤 2% ECL Prime Blocking Agent(RPN418)
5% ECL Blocking Agent(RPN2125)
一般的な試薬(5% スキムミルク、3% BSAなど)
2% ECL Prime Blocking Agent(RPN418)
5% ECL Blocking Agent(RPN2125)
一般的な試薬(5% スキムミルク、3% BSAなど)
5% ECL Blocking Agent(RPN2125)
一般的な試薬(5% スキムミルク、3% BSAなど)
5% ECL Blocking Agent(RPN2125)
一般的な試薬(5% スキムミルク、3% BSAなど)
リプロービング
(Amersham Hybondを使用)
対応
推奨メンブレン Amersham Hybond PVDF/Amersham Protran Premium NC
検出方法*3 X線フィルム
(Hyperfilm ECL)
CCDイメージャーImageQuant LAS 500
検出結果の例

*1 感度、発光時間は実験条件により変わることがあります。
*2 PVDF メンブレン使用時の目安
*3 最良の結果を得るためにはサンプルごとに条件検討を行って至適抗体濃度を決定する必要があります。

LOD = Limit of Detection DR = Detection Range


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グローバルライフサイエンステクノロジーズジャパン株式会社 個人情報管理責任者
個人情報保護に対する基本方針