抗体精製をマスターしよう　（6）

ポリクローナルIgGの精製プロトコール

今回からは、いよいよ実際の抗体精製プロトコールをご紹介です。今回は、研究分野で高い頻度で用いられている抗体であるポリクローナルIgGの精製がテーマです。第5回の「抗体精製に用いるカラム・ゲル担体」でご紹介した、カラム・ゲル担体を用いた実例もあります。ぜひ、ご参考になさってください。

• ポリクローナルIgG の精製の前に
• HiTrap™ 抗体精製カラムを用いた精製プロトコール
• ポリクローナルIgG のアフィニティークロマトグラフィー精製例
  • マウス ポリクローナルIgG の精製
  • ウサギ ポリクローナルIgG の精製
  • ヒツジ ポリクローナルIgG の精製
  • マウス ポリクローナルIgG のサブクラス分離

ポリクローナルIgG の精製の前に

精製を始める前に、リガンドとカラムサイズの選択について、考えておきましょう。

リガンドの選択

ポリクローナルIgG は、抗原を動物に免疫して作製した抗血清から精製します。IgG とProtein AまたはProtein G との親和性は、動物種により異なります。第1回でご紹介した「図6　代表的な抗体クラスの生物学的性質」を参考にリガンドを選択してください。

本記事下部の、ポリクローナルIgG のアフィニティークロマトグラフィー精製例の項で、動物種ごとの親和性について触れていますので、こちらもご参照ください。

カラムサイズの選択

血清中のIgG 濃度は10 mg/ml を超えるので、血清量が多い場合は5 ml カラムを使用してください。

それでは、具体的なポリクローナルIgG精製のプロトコールを確認しましょう。

HiTrap™ 抗体精製カラムを用いた精製プロトコール

準備するバッファー

• 結合バッファー：　20 mM リン酸ナトリウム, pH7.0
• 溶出バッファー：　0.1 M クエン酸ナトリウム, pH 3.0～6.0　（HiTrap™ Protein A の場合）
  　　　　　　　　　　0.1 M グリシン-HCl, pH 2.7～3.0　（HiTrap™ Protein G の場合）
• 中和バッファー：　1.0 M Tris-HCl, pH 9.0

サンプルの調製

1 ml カラムへの添加血清量の計算

おおよその血清中のIgG 濃度を 10 mg/ml として、カラムの最大結合容量から添加量を計算します。実際に添加するサンプル量は、その1/2 までにします。（最大添加量については下記リンク先をご参照ください。
抗体精製をマスターしよう (5)　「結合容量とサンプル添加速度」の項

カラムの劣化を防ぐために、塩析法（下記リンクを参照）でサンプルを調製します。保存中に沈殿を生じる場合もあるので、添加直前に遠心分離（12,000 × g, 10 分）または0.45 µm フィルターでろ過してください。
塩析法について：抗体精製をマスターしよう (4)　「サンプルの清澄化」の項

ポリクローナルIgG のアフィニティークロマトグラフィー精製例

原料となる抗血清中には、抗体のほかにAlbumin やTransferrin、リポタンパク質など様々な血清タンパク質が高濃度に存在します。イオン交換クロマトグラフィーは高い分離能と処理スピード、高吸着容量が特長で、タンパク質精製の初期段階で多用されています。しかし、血清が原料の場合には、これらの血清タンパク質もカラムに吸着するため、イオン交換クロマトグラフィーだけでは高純度の抗体を精製できません。

ここで紹介するProtein A やProtein G をリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィーは、これらのリガンドがIgG のFc 領域と強い親和性を持つことを利用した精製法で、IgG をワンステップで高純度に精製することができます。IgG のProtein A やProtein G に対する親和性は、動物種やサブクラスによって異なります。「代表的な抗体クラスの生物学的性質」を参考にして、適切なリガンドを選択してください。

マウス　ポリクローナルIgG

マウスIgG はProtein A よりもProtein G の方が強く結合します。この例では0.3 ml のマウス血清からポリクローナルIgG をHiTrap™ Protein G 1 ml で精製しました。マウスIgG をProtein A カラムで精製する場合には、サンプルおよび結合バッファーの組成を変更する必要があります。（これらの組成については、後日ご紹介します）

ウサギ　ポリクローナルIgG

ウサギIgG はProtein A やProtein G のどちらにも強い親和性を示します。1.3 ml のウサギ血清をサンプルとして、HiTrap™ Protein A　5ml で精製した例を示します。

【精製の流れ】

5 ml の結合バッファーを送液後、サンプルを添加しました。
↓
15 ml の結合バッファーで洗浄、10 ml の溶出バッファーで溶出を行いました（試験管には前もって数滴の中和バッファーを入れておき、すぐに溶出画分を中和しました）。
↓
最後に5 ml の結合バッファーでカラムを再平衡化しました。

• サンプル：1.3 ml のウサギ血清（ 0.45 μmフィルターろ過処理）
• カラム： HiTrap™ Protein A　5ml
• 結合バッファーA： 20 mM リン酸ナトリウム, pH 7.0
• 溶出バッファーB： 0.1 M クエン酸ナトリウム, pH 3.0
• 中和バッファー： 1 M Tris-HCl, pH 9.0
• 流速： 4.0 ml/min（119 cm/h）

ヒツジ　ポリクローナルIgG の精製

ヒツジIgG はProtein A への結合が弱いのでより強い親和性を示すProtein G を選択します。ヒツジ IgG とProtein G の結合の強さについての詳細は「代表的な抗体クラスの生物学的性質」をご参照ください。2.5 ml のヒツジ血清からポリクローナルIgG をHiTrap™ Protein G 5 ml で精製した例を示します。

【精製の流れ】

5 ml の結合バッファーを送液後、サンプルを添加しました。
↓
15 ml の結合バッファーで洗浄、10 ml の溶出バッファーで溶出を行いました（試験管には前もって数滴の中和バッファーを入れておき、すぐに溶出画分を中和しました）。
↓
最後に8 ml の結合バッファーでカラムを再平衡化しました。

• サンプル：2.5 ml のヒツジ血清（ 0.45 μmフィルターろ過処理）
• カラム： HiTrap™ Protein G 5 ml
• 結合バッファーA： 20 mM リン酸ナトリウム, pH 7.0
• 溶出バッファーB： 0.1 M グリシン-HCl, pH 3.0
• 中和バッファー： 1 M Tris-HCl, pH 9.0
• 流速： 3.0 ml/min（90 cm/h）

マウス　ポリクローナルIgG のサブクラス分離

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Protein A やProtein G を利用したアフィニティークロマトグラフィーにより、ワンステップでIgG を高純度に精製することができます。動物種やサブクラスを考慮したProtein A、Protein G の選択がポイントであることが、ご理解いただけたかと思います。

次回は、モノクローナルIgG の精製プロトコールをご紹介します。