カバレッジアッセイを用いたHCP ELISAの改善

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宿主細胞由来タンパク質（HCP）の定量に関してELISAは標準的な手法ですが、すべてのアッセイが同等に作られているわけではありません。優れたカバレッジアッセイ（カバー率）は、HCPを最小に抑え、開発を順調に維持するのに役立ちます。HCP ELISAに関する最近の技術革新が、検査および精製の改善にどのように寄与しているかをご紹介します。

この記事はGenetic Engineering and Biotechnology Newsで初出掲載されたものです。

現代のバイオテクノロジーでは、細胞を利用して、従来よりも有効かつ的を絞った医薬品を作ることができます。

しかし、生きている細胞を扱うには課題が伴います。細胞は目的の医薬品を生産しますが、細胞自身が生存するために必要なタンパク質やその他の分子も作り続けています。

そうした副生成物の中には、後になって問題を引き起こすものがあります。例えば、宿主細胞由来タンパク質（HCP）は治療用のタンパク質を分解して収量を減少させる可能性があります。また、それらが最終製品に残存すれば、免疫原性のリスクを高める可能性もあります[1]。

最終製品におけるHCP濃度を最小限に抑えるよう、HCPを特定・除去することは製造者の責任です。

HCPの定量には酵素免疫測定法（ELISA）を利用できますが、最良のアッセイであっても細胞由来タンパク質のすべてを認識することはできません。そのため、製造者はアッセイがカバーできる範囲（カバー率、カバレッジ）を評価し、それを利用してダウンストリームで必要なタンパク質除去工程を決定する必要があります。

この記事では、HCP ELISAカバレッジアッセイにおける最近の技術革新が検査の合理化と開発の促進に役立つことについて考察します。

HCPの定量

「HCPはバイオ医薬品製造において、製造工程由来の不純物とみなされています。」と、Cytivaのイメージング＆ウェスタンブロッティング担当プログラムマネージャーであるJoe Hirano博士は述べています。「除去のために多大な努力がなされていますが、バイオ医薬品では、最終製品に微量のHCPが存在します。」

Joeは、この課題には理由があると語っています。「定量測定は難しい仕事です。これまでのところ、医薬品に含まれる微量のHCPをすべて検出できるほどに特異性と感度に優れた方法はありません。より良い除去方法を開発するには、もっと特異性と感度の高い優れた測定法が必要です。」

測定法

ウェスタンブロットイメージングの時間短縮に貢献する生体分子イメージャーImageQuant 800

宿主細胞由来タンパク質の全体像を把握することは工程開発の重要な一部であり、ダウンストリームの精製工程を最適化する上で重要な役割を果たします。

ELISAは現在のHCPの標準的定量法です。研究者は、変更を加えていない細胞株からタンパク質を回収し、動物を使用してこれらのタンパク質に対する一群のポリクローナル抗体を作成します。この抗体を用いて、サンプル中のHCPに結合して定量することが可能なELISA測定法を開発します。次いで、工程開発者は同じELISA法を用いてHCP濃度を測定し、精製の各工程でHCPがどの程度除去されたかを確認します。

液体クロマトグラフィー―質量分析法（LCMS）のような他の方法を、回収した細胞培養液（HCCF）の分析やHCPの定量に用いることも考えられます。

しかし、Cytivaの不純物試験担当グローバルプロダクトマネージャーであるAnne-Sophie Brèsは以下のように述べています。「質量分析には高度な技術を持つオペレータと、高価な装置へのアクセスが必要です。現時点では、こうしたプロセスは時間とコストがかかりすぎて実用的ではありません。」

アッセイの課題

HCPの分析への挑戦

動物は宿主細胞由来タンパク質のすべてに対して抗体を産生するわけではないため、こうした抗体を用いて行われる酵素免疫測定法も、すべてのHCPを認識するわけではありません。この不一致はアッセイのカバレッジ（カバー率）と呼ばれます。

HCP ELISAは現在の標準的手法ですが、制約もあります。ある細胞株が産生するすべてのHCPを検出できるアッセイは存在しません。その理由は抗体が作られる方法にあります。

研究者は、細胞株から抽出したHCPを動物に注射してELISA用の抗体を作製します。動物はこれに反応して抗体を産生します。抗体は外来タンパク質に結合し、免疫系がそれらを除去できるようにします。このようにして得られる抗体がアッセイの基礎となっています。しかし、免疫された動物は、個々のタンパク質に対して等しい免疫反応を示すわけではないため、すべてのHCPに対応する抗体を備えたELISAはありません。言い換えれば、一部のHCPは他のHCPよりも免疫原性が高いということです。最大に見積もっても、動物が抗体を産生するのはタンパク質のうち70～80%です。これはすなわち、結果として得られるELISAにおいて、その細胞に由来するHCPのうち約3分の1が見逃される可能性があるということを意味しています。この不一致はアッセイの（カバー率）と呼ばれます。製造者にとってカバレッジは大きな懸念事項です。

Hiranoは以下のような見方を示しています。「各薬剤分子が後期臨床試験の第II相または第III相に入るとき、アップストリームおよびダウンストリームのすべてのバイオプロセスは製造に向けて固定されます。ある意味で、抗HCP ELISA抗体とバイオ医薬品製造工程は「キャッチ22^(*)」ともいうべき、動きがとれない矛盾した状況にあります。バイオ医薬品製造工程を最適化して完成させるには、非常に優れた抗HCP ELISA抗体が必要です。しかし、優れた抗HCP ELISA抗体を作るには、バイオ医薬品製造工程を完成させる必要があるのです。」

^(*)：同名の小説に由来する「矛盾した状況」を意味する英語のフレーズ

カバレッジの決定

HCP ELISAのカバレッジを決定するために、2Dゲル電気泳動と化学発光ウェスタンブロットを組み合わせて使用することがよくあります。

このアプローチでは、同一のサンプルを2枚のゲルで泳動して複製します。一方のゲルは染色を施し、他方のゲルはメンブランに転写してウェスタンブロット法で抗HCP ELISA抗体を施します。次に、これらの画像を重ね合わせて、ウェスタンブロット上のスポットのうち、染色でも検出されたスポットを特定します。この方法はELISAのカバレッジを効果的に評価できますが、時間がかかる上、技術的にも困難です。HCPをブロットに転写して画像を位置合わせすることはどちらも難しい手順であり、ゲル間およびブロット間のばらつきが結果に影響する可能性があります。これらの問題が組み合わさって、ELISAのカバレッジを決定する際の製造者の信頼が低下する可能性があります。

新しい技術―ディファレンシャルin-blot電気泳動法（2D DIBE™）―は、従来法によるカバレッジ評価の課題を解決できる可能性があります。DIBEでは、null細胞株由来のHCPを蛍光色素で前もって標識します。サンプルをゲル電気泳動で分離し、メンブランに転写してから、HCP ELISA抗体を適用してウェスタンブロットを実施します。波長が異なる別の蛍光色素を用いて、ウェスタンブロットのシグナルを検出します。その後、マルチチャンネル蛍光スキャナを使用して、ウェスタンブロットのシグナルと全HCPの蛍光シグナルを検出します。

さらに、研究者はカバレッジを視覚的に判断することが可能です。専用の2D画像解析ソフトウェアを用いることで、標識抗体に結合したタンパク質を特定することが可能です。このアプローチでは必要なゲルの数が少なくて済み、ばらつきが減り、結果の解釈がより容易になります。

その他の制約

ELISAのカバレッジに制約があることに加えて、製造者は他の課題にも直面しています。例えば、製造者は規制要件を満たすために、医薬品開発サイクル全体を通じてHCP濃度をモニタリングしなければなりません。つまり製造者は、その医薬品を製造している限り（場合によっては最大20年間）、使用するELISA抗体を安定的に供給する必要があるのです。

独自の抗体を製造する組織の場合は、製造コストが高くなったり、規制当局の認可プロセスに時間がかかったりする可能性があります。これを理由として、市販抗体を使用することを選ぶ製造者もありますが、それにはリスクが伴う可能性があります。抗体を外部委託するということは、製造元の変更が将来の供給に影響する可能性につながり、その結果として、アッセイ実施の能力にも影響します。

希釈の直線性とそれに関連する問題も、HCP ELISAに固有のもう1つの課題です。Hiranoは次のように説明しています。「HCP ELISA抗体は抗体の混合物であるため、一部の抗体は、サンプル中で検出されるHCPの全量を検出するには不十分かもしれません。すると、希釈サンプルでも読み取り値が低下しなくなります。サンプルを希釈しているにもかかわらず、同じ読み取り値が得られ続けるのです。」