HyClone™ characterized FBS — 産地の同等性調査

ウシ胎児血清（FBS）は、ウイルスベクターの製造を含む多くの細胞培養アプリケーションで依然として使用されています。一つの産地のFBSには限りがあるため、他の産地のFBSを使用することは、供給の安定性を高めるための一つの方法です。そこで、米国、ニュージーランド、オーストラリア産のハイクローンブランドのFBSを、いくつかの性能指標で評価しました。その結果、すべての測定項目においてロット内およびロット間のばらつきが少なく評価した血清の同等性が示唆されました。

はじめに

ウシ胎児血清（FBS）は、アカデミアや産業界におけるほとんどの付着性in vitro細胞培養アプリケーションの培地補助として使用されています。FBSには、タンパク質、ホルモン、成長因子などが複雑に含まれており、多くの異なる細胞や細胞株がin vitroの成長に必要とします。業界のトレンドは、血清を使用した接着細胞から、懸濁液に適応した細胞や化学的に定義された細胞培養液を使用することに変わりつつありますが、多くのアプリケーションでは依然として血清の補充が必要です。例えば、遺伝子治療やワクチンのためのウイルス生産などがあります。

ニュージーランド産のFBSは、閉鎖された牛群から採取されるため、初期の段階でよく選択されます。そのため、この原産地からの血清供給は限られています。研究、臨床、および本格的な製造のための供給の安定性を確保するためには、他の原産地からの二次的な供給源を検討することが重要です。しかし、それらの供給源からのFBSは、要求される性能と品質基準を満たさなければなりません。

プロセスの変動性をコントロールすることは、治療薬の開発と製造におけるもう一つの重要な側面です。これには、特定の供給源からの血清のロット内およびロット間の変動性を理解し、管理することが含まれます。FBSは乳製品や食肉産業の副産物として生産されており、ロット間のばらつきが観察される可能性があります。

そこで、アメリカ、ニュージーランド、オーストラリア産のHyClone™ characterized FBSを用いて、細胞培養と生産性能を評価・比較しました。実験では、付着性のHEK293T細胞を10％FBSを添加したHyClone™ DMEMを使用して調べました。

その結果、米国、ニュージーランド、オーストラリア産の10％FBSを添加したHyClone™ DMEMで培養した接着性HEK293T細胞において、細胞培養の動態、形態、トランスフェクション効率、ウイルス産生に識別可能な影響がないことが明確に示されました。さらに、ロット内変動やロット間変動を評価したところ、いずれのパラメータにも違いは見られませんでした。

結果と考察

血清の研究を見る：材料と方法

細胞の形態と成長のKinetics

HyClone™ FBSの評価は、1ロットにつき3本のフラスコ、1国につき3ロットのフラスコを使用し、n=27の実験条件で行いました。凍結保存された細胞を融解して継代した後、一般的な形態、細胞増殖の動態、および集団倍加時間（PDT）を評価しました。n=27の血清条件をすべて含み、T25細胞培養フラスコで並行して培養しました。週に2回細胞の観察と継代を行い、PDTと生存率を経時的に記録しました。

いずれの血清を添加したDMEMで培養したHEK293T細胞を比較しても、細胞の形態に違いは見られませんでした（Fig 1）。さらに、個々のPDT（Fig 2）、平均的なロットのPDT（Fig 2）、国ごとの経時的な平均PDT（Fig 3A）、全体的な組み合わせの平均PDT（Fig 3B）についても違いは認められませんでした。

Fig 1. (A) US、(B) NZ、(C) AUSの10% FBS添加DMEMで培養したHEK293T細胞の細胞形態の代表画像。10倍に拡大。

 

Fig 2. (A, B)US、(C, D)NZ、(E, F)AUSの10%FBS添加DMEMで培養したHEK293T細胞の個々のPDT、ロットごとの平均PDT、および生存率。複製は、ロット番号の後に1、2、3と表記した（例：US23はlot 2, replicate 3）。

 

Fig 3. (A)時間経過に伴う平均PDT数、(B)国ごとの全体的な平均PDT数。描かれているエラーバーは標準偏差。

トランスフェクションとトランスフェクション効率

AAV2トランスフェクションから72時間後、収穫前に、トランスフェクションされた細胞が緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現しているかどうかを、蛍光顕微鏡を用いてモニターしました。選択したサンプルの画像を保存し、明視野画像と蛍光画像の両方で比較ています。その結果、トランスフェクション後の細胞全体の形態や蛍光に違いは見られませんでした（Fig 4）。

Fig 4. (A, B)US、(C, D)NZ、(E, F)AUSの10%FBS添加DMEMで培養したHEK293T細胞のAAV2トランスフェクションから72時間後の代表的な(L)明視野画像と(R)蛍光顕微鏡画像。

 

フローサイトメトリーを用いてトランスフェクション効率を分析し、各サンプルの全生細胞中のGFP⁺細胞の割合を定量化するゲーティング戦略を採用しました。2つのサンプルを用いて2回のトランスフェクション実験を行いました。FBSロットごとのトランスフェクション効率を比較しても（Fig 5A）、国ごとのトランスフェクション効率を比較しても（Fig 5B）、目立った違いは見られませんでした。

Fig 5. 平均的なAAV2トランスフェクション効率は、トランスフェクション後72時間で(A)はロットごとに。(B) 国別。すべてのデータは標準偏差で表示されています。

ウイルスの力価

トランスフェクション後72時間後にサンプルを採取し、-80℃で3回凍結融解しました。凍結融解を繰り返した後、サンプルを10,000×gで遠心分離して上清を明らかにし、酵素結合免疫吸着法（ELISA）、qPCR、およびトランスダクションアッセイ分析を用いたウイルス力価分析のために分注しました。2回のトランスフェクション実験から得られたすべてのサンプルは、3つの方法を用いて重複して2回試験しています。その結果、FBSの全ロットを比較しても（Fig 6A、C、E）、国別に比較しても（Fig 6B、D、F）、ELISA、qPCR、感染性ウイルスの力価に違いは見られませんでした。

Fig 6. 2回のトランスフェクション実験の結果。(A, B)平均ELISAウイルス力価、(C, D)qPCRウイルス力価、(E, F)感染性ウイルス力価、それぞれFBSロットごと、国ごと。すべてのデータは、平均ウイルス力価/Lと標準偏差で示した。

結論

本研究では、3カ国のHyClone™ブランドのFBSを、1カ国につき3つのロット、1つのロットにつき3つのフラスコを使用し、合計n=27の異なる条件で並行して比較しました。FBSの性能は、単一の接着性HEK細胞株を用いて評価しています。観察された全体的なばらつきの少なさは、含まれるFBSロットの品質や性能に差がないことを示唆していますが、これらの結果を他の細胞株やプロセスをカバーするために外挿することはできません。

一般的な細胞培養実験の性質と、複数の培養を経時的に比較した場合に見られるばらつきを考慮すると、観察されたパラメータにばらつきがなかったことは、米国、ニュージーランド、オーストラリア（AUS）産の10％FBSを添加したHyClone™ DMEMで培養した付着性HEK293T細胞の細胞培養の動態、形態、トランスフェクション効率、またはウイルス産生に識別可能な影響がなかったことを示しています。さらに、ロット間およびロット内のばらつきを評価したところいずれのパラメータにも違いは認められませんでした。

その結果、米国、ニュージーランド、オーストラリア産のCharacterized HyClone™ FBSの性能には、観察可能な差がなかったことが明らかになりました。

米国、NZ、AUS産のHyClone™ characterized FBSについて

HyClone™の血清を作るための製造工程は、国際血清工業会（ISIA）によってトレーサビリティーが認証されています。さらに製品のトレーサビリティをサポートするために、Scientific Traceability by Oritainをいち早く採用し、アメリカ、オーストラリア、ニュージーランドのプレミアム牛血清製品の原産国を証明しています。異なる地域のプレミアム牛血清サンプルを分析し、オリテインは各原産国に固有の「Origin Fingerprint」をデータベース化しています。Fig 7は、HyClone™血清のボトルに貼られたラベルの一例です。

Learn more about:

HyClone™ characterized FBS, U.S. ／ New Zealand ／ Australia origin

Fig 7. HyClone™血清のボトルに貼られたラベル、ニュージーランド原産で、原産国を確認。