この記事は、自動翻訳ソフトウェアによって翻訳されています。自動翻訳によって生成された記事（Cytivaにより見直された記事を含む）には、単語、構文、文法などの間違いが含まれている場合があります。弊社は、コンテンツの不正確な翻訳またはその使用により生じる間違いや誤解、または損傷に対して責任を負いかねます。あらかじめご了承ください。
抗体精製プロセスは、通常、プラットフォーム・アプローチとを用いて開発されます。単一ユニットの最適な動作条件は、実験計画法（DoE）の手順またはハイスループットスクリーニングにより少数のプロセスパラメーターのみを変更することで特定します。しかし、DoEで堅牢なプロセス条件を特定できない場合はどうすればよいでしょうか。
はじめに
プラットフォームアプローチでは、クロマトグラフィー精製ステップのいくつかのパラメーターのみを新規分子用に調整します。次に、実験計画法（DoE）に基づく高解像度スクリーニング実験を用いて残りのデザインスペースを探索します。このアプローチはほとんどのプラットフォーム分子について有効ですが、サンプル量が多く、オフラインでの広範な分析が必要であり、校正済みの実験範囲に限って使用できます。
この事例では、2段階溶出を用いたポリッシングのステップで生じる製造スケールでの分離の問題を分析しました。課題は、高い収率と純度を維持し、吸着剤材料を保持しながら、重要な凝集体およびフラグメントを含む混合物から抗体を分離することでした。プラットフォームプロセスに基づくプロセス開発アプローチをDoEと併せて使用した場合には、収率が65%を超える適切なプロセスを見出せませんでした。これに対し、流体原理および熱力学原理を用いてサンプル成分の輸送を記述するメカニスティックモデルでは、in silicoで効率的にプロセスを最適化することができました。
材料および方法
この事例では、大容量の陽イオン交換レジンを使用しました。標的成分は中間溶出抗体でした。低分子量（LMW）1種と高分子量（HMW）2種を除去することにしました。シミュレーション、パラメーターの推定およびプロセスの最適化はすべてGoSilico™クロマトグラフィーモデリングソフトウェアを用いて行いました。クロマトグラム上では不純物はほとんど視認できませんでしたが（図1）、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）分画分析（図2）ではLMW不純物と標的抗体が強く重複し、LMW不純物の除去率は70%未満となることが示されました。
図1. 15 CVグラジエントにおける陽イオン交換クロマトグラフィー（CEX）溶出プロファイル
図2. SEC法による分画分析は、溶出液中にフラグメントと凝集体を確認
モデル校正
このモデルは、カラム接続およびカラム非接続の2回のトレーサーランと、非線形モードの3回のグラジエント溶出を用いて校正しました。オフラインSEC分画分析で追加情報を得ました。図3と図4に破線で示したように、SECで測定した相対的分画含量から、GoSilico™クロマトグラフィーモデリングソフトウェアが自動的に疑似クロマトグラムを作成しました。未知のモデルパラメーターはすべて、カーブフィッティングで決定しました。プロットは全体の結果と不純物のクローズアップを示しています。
図3.. シミュレーションによる単一成分曲線（実線）および分画データ（破線）
図4. 図3の不純物曲線（実線）および分画データ（破線）を拡大したシミュレーション
モデルベースのプロセス開発
GoSilico™クロマトグラフィーモデリングソフトウェア内でモデルの校正行えば、その後のプロセス開発および最適化はコンピューターのみで行うことができます。DoE実験と比較して、負荷量は75%減少し、カラム長は50%増加しました。塩溶出ステップの最適化と併せて、高い収率と純度を得ることができました。図5に最適化された設定を示します。図6に負荷量とカラム長を一定に保った場合の最適なプロセス設定を示します。バッファー液の塩濃度と段階／グラジエント形状のみを最適化できる場合は、標的抗体とLMW不純物が共溶出し、そのためLMW不純物の除去が必要となり製品の収率が低下します。その後の塩グラジエント溶出でも、共溶出するHMW不純物を回避することはできません（図6）。
図5. 最適化されたプロセス設定でシミュレーションしたクロマトグラムとKPIの予測値
図6. 部分的に最適化されたプロセス設定でシミュレーションしたクロマトグラとKPIの予測値
モデル品質
目視検査によるモデル適合度はきわめて良好でしたが、パラメーターが十分に特定されているかについて情報を得るには95%信頼区間を算出する必要があります。表1に各分子とモデルパラメーターについて算出した95%信頼区間を示します。立体質量作用吸着モデルでは、電荷パラメーターおよび平衡パラメーターの相対信頼区間はすべて低くなります。キネティクスは大きくなるものの、許容できる値にとどまります。決定できなかったパラメーターは低濃度分子種の立体遮蔽のみであり、この値は0に設定します。
| Parameter | Target | LMW | HMW 1 | HMW 2 |
|---|---|---|---|---|
| Kinetic | 4% | 22% | 9% | 78% |
| Equilibrium | 3% | 13% | 4% | 5% |
| Charge | 1% | 1% | 0% | 0% |
| Shielding | 1% | 2400% | 174% | 1992% |
プロセス理解の向上
DoEでは十分な収率が得られなかった理由もメカニスティックモデルで説明できます。LMW不純物の表面電荷は実際には標的抗体よりも低く、そのため先に溶出します。吸着等温線は凸形であるため、移動相濃度が高くなるとタンパク質は相対結合量として増加できなくなります。そのため、溶出中、高度濃縮標的タンパク質の濃度前線の移動速度が速くなります。実際は、標的ピークはLMW不純物を追い越していたため、負荷を減らすだけでこの問題を解決できました。