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TPP® TubeSpin® バイオリアクターチューブとReadyToProcess WAVE™ 25 Rockerバイオリアクターシステムを用いて、モノクローナル抗体（mAb）灌流プロセスの信頼性の高い小規模モデルを開発しました。

  • 50mLのTubeSpin細胞培養装置を用いた小規模モデルでは、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）灌流プロセスの収率を高めるためのプロセスパラメータの最適化が可能でした。検討したプロセスパラメータは、異なる日、異なる生細胞密度での37℃から31℃への温度変化でした。
  • 温度変化による収量への影響はありませんでした。しかし、より高い生細胞密度で操作することで、当社の標準的な灌流プロセスと比較して、同程度の体積生産性を達成しながら、製品の総収量を増加させ、1日の製品収量を40％向上させた。
  • ReadyToProcess WAVE™ 25バイオリアクターは、3日間（d）で0.85 g/L/dという同等の体積生産性を示しました。チューブ・スピン実験で使用したパラメータのスケールアップに成功したことで、小規模モデルの適合性が確認された。

はじめに

プロセスの強化が大規模な製造に採用されると、拡大した動作空間を正確に表現するスケールダウンモデルの責任が急速に高まります。灌流は、小規模なアプローチでは複雑さが増す一方で、製造規模ではメリットが得られるような操作モードの一つです。

記載されている研究の目的は、ReadyToProcess WAVE™ 25 RockerバイオリアクターおよびWAVE™ Cellbag™ 50 Lにおける当社の灌流プロセスの信頼できる小規模モデルを開発することでした。この小規模モデルを使用して、灌流プロセスの収量を増加させることができるプロセスパラメータをスクリーニングすることが目的でした。この研究では，温度のダウンシフトが異なるCHO細胞によるタンパク質生産に有利である可能性を示す文献的証拠（参考：文献1参照）に基づきプロセスパラメータである温度と生細胞密度をさらに検討した。チューブ-スピン装置の主な目的は、37℃から31℃への温度シフトの効果を調べ、このシフトを導入する正確なタイミングが細胞培養の生産性に及ぼす影響を特定することでした。

Materials and methods

温度シフト評価のためのチューブ・スピン実験

温度シフトの効果は、細胞培養の成長曲線の初期と後期の両方に相当する2日目と3日目（細胞密度約25〜35百万個/ml（MVC/mL））、4日目と5日目（細胞密度約50〜70MVC/mL）で調べた。37℃チューブスピンバッチの細胞培養は12日目に終了したが、温度変化を伴うチューブスピンの培養時間は15日間に延長された。

チューブスピン実験には、50 mLのTPP TubeSpinバイオリアクターチューブを使用し、メーカーの推奨事項に従って調製した粉末状のHyClone™ ActiPro™細胞培養液を使用しました。CHO細胞は、TubeSpinバイオリアクターチューブ内で腐植化したシェイクインキュベーター内で培養した。チューブは、インキュベーター内のチューブラックでロッキングプレート上に固定しました。チューブスピン実験のその他の条件をTable 1に示します。

0日目に、シェークフラスコの細胞濃度と生存率を、細胞生存率分析装置を用いて測定した。10MVC/mLの初期接種密度で5.6mLの作業容積でチューブスピンを開始するために必要な細胞懸濁液の量を算出した。チューブスピンは、温度シフト条件ごとに二重に、37℃対照条件では三重に開始した。必要量の細胞懸濁液を50 mLコニカル遠心チューブに移し、150 × gで7分間遠心分離した。上澄み液（使用済み培地）を除去した。必要な数の細胞を新鮮なHyClone™ ActiPro™細胞培養液に再懸濁し、細胞懸濁液を5.6 mLのワーキングボリュームを持つチューブスピンに移した。細胞密度、生存率、代謝物を分析するために抽出された0.6mLのサンプリングを補正するために、最初の培養に0.6mLの余分な容量を加えた。

1日目以降は、サンプリング量を除いて同じ実験手順に従った。インキュベーターに戻す前に、TPP TubeSpinバイオリアクターのチューブから300 µLの細胞培養サンプルを取り出しました。このサンプルのうち200 µLを細胞密度と生存率の測定に使用しました。

残った細胞ペレットを新しい灌流液に再懸濁した。細胞密度が50MVC/mLに達した時点で350×g、12分間の遠心分離を行ったことが重要である。

TPP TubeSpinバイオリアクターのチューブをインキュベーター内で37℃で培養しました。2日目、3日目、4日目、5日目に、2本のチューブを37℃から31℃に移し、15日目まで培養しました。

Table 1.50mLチューブ・スピン実験におけるCHO細胞の培養条件

Parameter

Setting
Incubator agitation rate 220 rpm
Orbital diameter 50 mm
Target inoculation cell concentration 10 × 106 viable cells/mL
Temperature 37°C and 31°C
CO2 incubator concentration 7.5%
Target viability > 95%
Volume of aliquot in TPP TubeSpin Bioreactor tubes 5 mL
Culture medium Day 0: Hyclone ActiPro™
Day 1-15: Hyclone ActiPro™, Hyclone Cell Boost™ 1, Hyclone Cell Boost™ 3 in a volumetric ratio of 1:0.139:0.158

ReadyToProcess WAVE™ 25システムのセットアップ

Table 2に従ってReadyToProcess WAVE™ 25システムを構成しました。

Table 2.厳選された細胞培養液とサプリメントの特徴

Parameter

Setting
Culture working volume 10 L (day 0) 20 L (day 1 and forward)
Dissolved oxygen (DO) control strategy At seed: 22 rpm, 6° angle
DO controlled by automatically increasing the
oxygen supply and increase in rpm
Interval for settings: 22-35 rpm, 6° to 10° angle
Perfusion strategy Start perfusion when cells have reached ~ 4 MVC/mL
Maintain a cell-specific perfusion rate (CSPR) of 20 pL/cells/day
Maintain controlled state at 70 MVC/mL by cell bleeding
Temperature setpoint 37°C
*pH setpoint Starting at pH 7.0 on day 0 and lowered to pH 6.8 on day 2
DO setpoint 40%
Gas flow rate at start 0.50 L/min
Target inoculation cell concentration 1.25 MVC/mL
Target viable cell concentration 70 MVC/mL (controlled state)
Target viability > 95%
Culture medium Expansion batch media: Hyclone ActiPro™
Perfusion media: Hyclone ActiPro™ with 2 g/L poloxamer 188,
13.94% CB1 (10% w/v stock solution),
15.80% CB3 (5% w/v stock solution)

CHO細胞は、0日目に10Lに1.25MVC/mLの細胞密度で接種し、1日目に最終容量20Lまで増量し、3日目に4.32MVC/mLの細胞密度で灌流を開始しました。9日目に細胞培養が72.5MVC/mLに達したので、細胞培養を70MVC/mLで安定させるためにブリードを開始した。12日目に70MVC/mLでの制御状態が3日間維持された時点で培養を終了した。

結果

チューブ・スピン実験

細胞の成長と生存率のプロファイルをFig 1に示し、条件ごとに2回または3回のチューブスピンの平均値を示しています。

31℃に温度をシフトしたすべての条件で、15日目まで90％以上の培養生存率が得られ（破線、Fig 1A）、対照温度である37℃での生存率が7日目以降に低下したのと比較して、良好な結果が得られた。

全体として、2日目、3日目、4日目に行った温度シフトでは、37℃のコントロールと比較して、温度シフトの翌日の細胞増殖率が低下しました（Fig 1B）。

Fig 1.5mLチューブスピン実験の細胞密度と生存率のプロファイル（A）および増殖率のプロファイル（B）。2日目、3日目、4日目、5日目に実施した37℃から31℃への温度シフト（TS）。

生産性および細胞特異的生産性は、Fig 2 AおよびBに表されています。全体として、生産性および細胞特異的生産性は、37℃のコントロール条件で最も高くなりました。

温度変化の翌日には、温度変化の時点とは無関係に生産性が低下しましたが、その後、生産性は日に日に向上しました。

最後に、Fig 2Cは、細胞の成長が0.4～0.5（1/d）を超えると、細胞の比生産性が高くなることを示している。

Fig 2.日間の生産性（A）、比生産性（B）、比生産性と成長率のプロファイル（C）。37℃から31℃への温度変化は、2日目、3日目、4日目、5日目に行った。

これらの結果から、2日目と3日目の初期の温度シフトに比べて、4日目と5日目の後期の温度シフトで最も有意に生産性が向上したことが示唆された。全体として、温度シフトは生産性を向上させなかったため、ReadyToProcess WAVE™ 25の灌流培養は37℃で行われた。

ReadyToProcess WAVE™ 25 cell culture

細胞の生存率は、灌流プロセス全体を通して98%以上であった。細胞密度は70 MVC/mLで3日間維持された。細胞の流出は、各サンプリング後に1日2回、手動で調整され、9日目から12日目にかけてうまく機能した。灌流液中には細胞は観察されず（データは示されていない）、灌流プロセス全体を通してフィルターが無傷であったことが示された。

ReadyToProcess WAVE™ 25 productivity

生成物の力価は時間とともに上昇し，制御状態では約0.7 g/Lに達した。バイオリアクターとフィルター後の灌流液の間に力価の有意差は見られず（Fig 3）、フィルターのファウリングによる製品の滞留がないことが示された。

希釈を考慮すると、体積生産性は一時的に1.0g/L/d以上に達したが、主に手作業によるブリーディングの介入により、0.7～0.9g/L/dの間で変動した（Fig.3）。

Fig 3.ReadyToProcess™WAVE™ 25のバイオリアクターと灌流液におけるmAbの体積生産性と製品濃度。

まとめ

チューブ・スピン実験を用いて、灌流プロセスの小規模モデルを確立した。その後、このプロセスをスケールアップし、50LのWAVE™ Cellbag™バイオリアクターで合計12日間実行しました。

  • 毎日の収穫サンプルは、70MVC/mLのコントロールされた状態で、3日間にわたり平均容積生産性0.85g/L/dで採取されました。
  • チューブスピン実験をWAVE™ 25バイオリアクターにスケールアップしたところ、同等の体積生産性が確認された。これにより、このセットアップは、細胞特異的な灌流速度と細胞密度を制御しながら灌流プロセスを開発するための適切な小規模モデルとして設計されていることが確認されました。
  • つまり、温度変化による収量への影響はなく、逆に生細胞密度を高くすることで、製品の総収量は40％増加しました。