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スケーラブルなアデノ随伴ウイルス（AAV）生産プロセス開発について知りたいことはありませんか？
Cytivaが、弊社のstart-to-finish processウェビナーに参加された方々から寄せられた質問にお答えします。

トランスフェクション、AAVベクター作製、採取

HEK 293T細胞では、付着細胞を懸濁液に適応させるのに何日くらいかかりますか？

直接適応を使用して約2ヶ月かかりました。細胞増殖をコントロールするために10回の継代を行い、実用的な細胞バンクを作製しました。生細胞密度（VCD）が高すぎると凝集塊が増えるので、2.5 × 106 cells/mLを超えないように適応中の細胞の凝集塊をコントロールすることが一つのコツです。

PEIを用いたAAVの一過性トランスフェクション法は、500Lまでスケーラブルに対応できますか？

そうですね、これは期待通りです。しかし、これまでのところ、AAV2については、20mLから20Lへのスケールアップしか行っていません。あるお客様は、Xcellerex™ XDRバイオリアクターで500Lまでスケーラブルにトランスフェクションを実施されています。

AAV2の溶解条件はどのように選択されたのですか？

私たちは、発表したアデノウイルスプロセスにおけるHEK293細胞の溶解について、さまざまな洗剤を比較し、凍結融解と比較する研究を行っています。Tween™ 20は良好なパフォーマンスを示しました。また、REACHリストには掲載されていません（健康や環境に優しく、大規模生産に使用できます）。

AAVの精製

Capto™ AVBクロマトグラフィー樹脂で回収率を最大化するために、何か推奨する方法はありますか？

はい、いくつかあります。カラムに負荷がかからないように注意してください。容量は非常に高く約1014/mL レジンです。収穫物のタイターが非常に低い場合、濃縮を試みてください。そして、異なる溶出手順（フローやバッファ）を試してみてください。また、ロードするサンプル中のタイターは回収率に影響します（タイターが高いほど有利です）。

Capto™ AVBレジンのAAV血清型に対する特異性は？

1, 2, 3, 5に結合します。しかし、6、8、10、およびいくつかの合成キャプシドにもうまく使用されています。9にはあまり結合しません。私たちは、より血清型に特化したイオン交換（IEX）の選択肢を検討する予定です。

濃縮とバッファー交換のステップでのAAV回収率は最大80%でした。20%の損失はどこにあったのでしょうか？

透過液を分析したところ、MWCO 300 kDaの中空糸膜フィルターでは、ウイルスは検出されませんでした。システムのチューブやフィルターにある程度トラップされている可能性もありますし、分析ミスという可能性もあります。90%から100%の回収率を達成したこともあります。ですから、一般的にはこのステップで非常に良い回収率が得られています。

AAV精製のためのCapto™ Coreテクノロジーの仕組みは？

これはフロースルーの手順です。ウイルスは大きさの関係で通過し、不純物は孔の中に入り込み、中のリガンド（オクチルアミン）と結合します。Capto™ Core 400とCapto™ Core 700があります。AAVにはCapto™ Core 400が適しています。400と700は、ビーズの外殻のMWCOを反映しています。

Capto™ Core 400は、完全なAAVキャプシドと空のキャプシドを分離することができますか？

いいえ、Capto™ Core 400は、AAVから宿主細胞タンパク質やDNAなどの不純物を除去するために使用されます。Capto™ Coreの不活性なシェルは、フルカプシドと空カプシドが同じような大きさであるため、区別しません。

空のAAVキャプシドの除去方法は？

拡張性を求めるならイオン交換（IEX）クロマトグラフィーです。Full/Emptyの分離についてはまだ研究中ですが、Capto™ Q ImpRes または Capto™ Q はほとんどの血清型に適していると考えています。また、上流の生産を最適化することにより、調製品中のフルキャプシドの割合を最大化することをお勧めします。

Fibro技術のAAVに対する結合能力は？

まだ、いろいろなプロトタイプを使っただけなので、この情報はありません。一般に、レジン製のAAVキャプチャーと比較すると、結合能力は2倍になります。これは、Fibroのウイルス結合面が高いためと思われます。また、AAVキャプチャーのクロマトグラフィーを高流量で行えることもFibroの利点です。

AAV解析

AAVの力価測定はどのような方法で行っているのですか？

私たちは、酵素免疫吸着法（ELISA）と表面プラズモン共鳴法（SPR）のBiacore™アッセイという2つの類似したアッセイを使用しています。ATCC参照標準と比較すると、非常によく似た値が得られます。しかし、Biacore™アッセイでは、ばらつき（CV％）が小さくなっています。

AAV調製液に残存するDNAの不純物を確認しましたか？

これまで、全DNAのPicoGreen™分析を行ってきました。アフィニティステップの後、DNAは検出限界（1 ng/mL）以下であり、検出できませんでした。今後は、すでにセットアップしているHEK293 DNAのqPCRを行う予定です。AAV DNAのqPCRでは、プラスミドからのバックグラウンドを常にチェックし、プラスミドからのバックグラウンドを完全にコントロールできるように慎重にアッセイをセットアップしています。qPCRアッセイでは、バックグラウンドは全くないか、あるいは非常に低いことが確認されています。

AAVのカプシドがEmptyかFullかは、どのように判断するのですか？

今のところqPCRとELISAの比率です。しかし、両アッセイともばらつきがあるため、これは少し不確かです。もっと良い方法が必要だと考えているので、蛍光検出によるHPLC法、透過型電子顕微鏡（TEM）分析、その他簡単で短時間ででき、AAVをあまり消費しない方法なども検討しています。これには分析用超遠心法（AUC）が良いのですが、迅速性に欠けるため、利用できません。

遺伝子治療製品およびプロセス（例：AAV）におけるウイルスクリアランス試験は、どのように管理されているのでしょうか？

原料が汚染されていないことが重要なのです。しかし、精製するウイルスとそれに耐えられるものによっては、低pHや洗浄剤によるステップを導入することで、より敏感なウイルスもクリアにすることができます。