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二次元電気泳動のサンプル調製における注意点

タンパク質解析手法の中でも、二次元電気泳動はサンプル調製（サンプル溶液の状態）が結果に占める重要度が高いです。塩をはじめとした泳動を阻害する夾雑物を、どのようにして除くかがポイントになります。タンパク質沈殿法や脱塩・バッファー交換を組み合わせて、効果的にサンプル調製を行いましょう。

このページの目次

塩を徹底的に除く

一次元目の等電点電気泳動でタンパク質のフォーカシングがうまくいかない原因のほとんどは、サンプル中に残存する塩にあります。

Immobiline™ DryStripを用いた等電点電気泳動では、SDS-PAGEに比べて塩による影響が大きく、サンプル中の塩濃度は10 mM以下に抑える必要があります。サンプルカップを用いたカップローディング法によるサンプル添加では、50 mMまで塩濃度を上げることができますが、可能かぎり塩は除去しましょう。

下図に泳動パターンに対する塩の影響を示しました。また、一次元目の等電点電気泳動中に「電圧が上がらない」、「BPB色素がゲルの端まで流れきらない」などの現象が見られる場合も、サンプル溶液中に塩が含まれている可能性が高いです。

このような場合には、泳動前に脱塩のステップを加えましょう。TCA/アセトン沈殿がよく用いられます。脱塩カラムなど担体を用いた脱塩方法では、サンプルの担体への非特異吸着が起こります。これを抑制するためには0.15M程度の塩の添加が必要ですので、あまり適していません。

脱塩・バッファー交換のページ

サンプル溶液の濃縮のページ

30 mM NaCl Non Salt
図　塩の存在による二次元電気泳動パターンへの影響

同サンプルを用いて溶解バッファーに含まれる塩の影響を検証しました。30 mM NaCl 存在下のパターン（左図）では、縦筋、横筋、スポットの空白部分がみられますが、塩非存在下（右図)ではきれいにスポットが分離されています。

塩以外に泳動を阻害する物質を以下に挙げます。

  • 核酸（DNA・RNA）
  • 多糖類
  • 脂質
  • フェノール化合物
  • イオン性界面活性剤
  • 細胞由来の荷電物質
  • 不溶性物質

これらの物質もできるだけ除去する必要がありますが、多くの物質はTCA／アセトン沈殿、または2-D Clean-Up Kitにより除くことができます。

関連製品

2-D Clean-Up Kit製品写真

塩以外の不純物も徹底除去！
2-D Clean-Up Kit

二次元電気泳動における不純物を徹底して除去することで、スポットパターンをクリアにします。発現量比較には欠かせません。

不純物の少ない試薬（ハイグレード試薬）を使う

サンプル溶解バッファーや電気泳動に用いる試薬（例：尿素、チオ尿素、Tris、SDS）は、不純物の少ないハイグレードの試薬を使うことが望まれます。低グレードの試薬は荷電性・不溶性の夾雑物を含むことがあり、これらは泳動を阻害します。

尿素やチオ尿素はグレードの高い試薬であっても、微量の荷電物質を含むことがあります。イオン交換樹脂であるアンバーライト（Amberlite IRN-150L）を用いて処理することで、このような荷電物質を除くことができます。

マークアンバーライトによる清澄化　プロトコール
  1. バッファー成分の内、尿素/チオ尿素のみを先に溶解する。
  2. 1～数％（w/v）のアンバーライトを加え、1時間撹拌する。
  3. 溶液をろ過してアンバーライトを除き、Trisなど残りの試薬を加え溶解する。

また、調製してから長期間保存した試薬では、泳動に悪影響を与える場合があります。凍結融解のくり返しは避け、一定期間内に使うようにします。

※たとえば、弊社が推奨する二次元電気泳動用のサンプル溶液（30 mM Tris（pH8.5）, 7 M尿素, 2 Mチオ尿素, 4％CHAPS, 5 mM酢酸マグネシウム）では、-20℃で3ヶ月間は保存可能です。

塩基性タンパク質の分離改善のために

pH7以上の塩基性領域では、通常サンプル溶液の還元剤として含まれるDTT（ジチオスレイトール）が作用しにくくなり、システイン残基の還元が不十分になります。システインの酸化はタンパク質間の非特異的な凝集や尿素との反応を引き起こし、泳動パターンには乱れが生じます。

できるだけ塩基性領域のタンパク質分離の改善するための、サンプル調製・サンプル添加法をご紹介いたします。

DeStreak Reagentsの使用

Destreak Reagents 製品写真従来の還元剤に変わるチオール修飾試薬であり、塩基性におけるタンパク質の非特異的酸化を防ぎます。システインの多い動物由来サンプルにも有効です。

下図にDeStreak添加の効果を示しました。塩基性側のストリーキングが明らかに改善していることがわかります。

従来の膨潤バッファー DeStreak添加
図　DeStreak添加による塩基性領域の泳動パターン改善

サンプル：マウス肝臓抽出タンパク質　80 µg
Immobiline™ DryStrip：pH6-9, 24cm

【サンプル溶解液】
左：8M Urea, 0.5％ CHAPS, 10 mM DTT, 1％IPG Buffer, pH 6-11
右：上記組成＋DeStreak Rehydration Solution

Cup Loading Strip Holderによるサンプル添加　 （IPGphor™利用の場合）

Immobiline™ DryStripへのサンプル添加をカップローディングホルダー（Cup Loading Strip Holder）で行うことで、スポット分離が改善され泳動時間も短縮できます。

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