クロマトグラフィーのサンプル調製における注意点

脂質や細胞片などの微粒子は遠心分離により除去できます。遠心後もサンプルが清澄化されていないときには、ろ紙や粗めの5 µmフィルターでろ過した後に、次項目のフィルターろ過操作を行ってください。

その他の微粒状物質はフィルターろ過により取り除きます。セルロースアセテートやPVDFのような、タンパク質の非特異的吸着が少ない材質を使用します。

クロマトグラフィー前のサンプル調製では、担体の粒子径によってフィルターのポアサイズを選択します。

最も注意するべきことは、担体への結合を阻害する塩やイオン性界面活性剤などの荷電性物質です。これらの物質はあらかじめ混入しないような操作手順にするか、脱塩やバッファー交換の操作によって除くか、どちらかを行ってください。

また、バッファーのpH強度にも気をつけましょう。サンプルを溶解した時点で溶液時に調整したpHは変化します。クロマトグラフィー処理前には必ず確認しましょう。

きれいな分離能を求めるには、サンプル溶液量、濃度、粘性が重要です。

通常、ゲルろ過での分離におけるサンプル溶液量はベッド体積の0.5～4％が推奨ですが、2％以下に抑えることが望ましいです。サンプルの複雑さや分離ピークの近接状況にもよりますので、実験を行いながら至適化します。

サンプル濃度は高いほどよいですが、70 mg/mlぐらいが上限です。濃度が濃すぎるとサンプル溶液の粘性が上がり、カラム中での分子量に応じた挙動が阻害され分離が悪くなります。

また、サンプルが非特異的に担体へイオン結合することで、ピーク溶出が遅れる現象が起こります。これを抑えるためには、送液バッファーに0.15 M NaCl程度の塩を添加します。

担体への吸着は静電的作用の低い高塩濃度下で行うため、サンプル溶液の塩濃度も高めておきます。イオン交換クロマトグラフィーや硫安沈殿（または硫安分画）処理後のサンプルはすでに高塩濃度であるため、これらの処理後のサンプルをそのまま用いることが多いです。

アフィニティーの原理によってサンプル調製は異なりますので、プロトコール例やマニュアルをよく確認してください。少なくとも結合を阻害するような物質は、サンプル溶液から取り除きましょう。

たとえば、金属イオンをリガンドとした担体によるHis-tagタンパク質精製では、金属イオン性プロテアーゼ阻害剤であるEDTAは、担体と金属イオンの結合を阻害します。したがって、サンプル溶液にEDTAが含まれないよう注意します。