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高密度のN-1シード培養は、生産（N）バイオリアクターのシードをより高い開始密度で行うことや、大型のN-1バイオリアクターを置き換えることを可能にすることで、フェッドバッチプロセスを改善することができます。本研究では、Xcellerex™自動灌流システム（APS）と容量50LのXcellerex™撹拌槽バイオリアクターを用いて、このような培養物を調製する方法を示しています。我々が開発したプロセスでは、最終的に179百万個の生存細胞（MVC）/mLの細胞密度が得られました。灌流法で培養した細胞は、N-1の標準的なバッチプロセスで培養した細胞と同様に、フィードバッチ培養のシードに使用しました。その結果、N-1工程に灌流を導入しても、成長性、生産性、製品の品質プロファイルに影響を与えないことがわかりました。

N-1灌流の紹介

N-1 パーフュージョンとは、灌流を導入することで、最終的なシードトレインのステップを強化することです。灌流プロセスは、細胞培養に新鮮な培地を連続的に供給し、バイオリアクター内に細胞を保持しながら使用済みの培地を除去するプロセスです。

高密度N-1種培養プロセスは、生産バイオリアクターに高い開始密度で播種することで、フェッドバッチプロセスを改善するために使用することができます(1-3)。あるいは、より大きなN-1バイオリアクターに置き換えて、1つまたは複数の生産バイオリアクターにシードすることもできます。その結果、施設の生産速度の向上、投資コストの削減、施設の設置面積の縮小など、生産コストの削減が可能になります。

本研究では、凍結したmAb産生CHO細胞を融解し、シェークフラスコでサブカルチャー化しました。次に、細胞をReadyToProcess WAVE™ 25バイオリアクターに移し、N-2ステップを行いました。次に、この培養液をXDR-50バイオリアクターに播種し、Xcellerex™ APSを用いてN-1ステップの灌流を行いました。最後に、灌流した細胞を用いてシェイクフラスコでフェッドバッチ培養を行いました。このフェッドバッチ培養は、N-1で灌流を強化した後も、細胞が増殖・生産能力を維持していることを実証するために行ったものです。

詳細はMaterials and Methodsをご覧ください。

結果と考察

APSスキッドを用いたXcellerex™ XDR-50でのN-1パーフュージョン

我々は以前、ReadyToProcess WAVE™ 25バイオリアクターにおいて、5Lおよび25LスケールのN-1灌流プロセスを開発しました。いずれのスケールでも、指数関数的な成長と安定したDO制御により、70～95 MVC/mLの範囲の最終密度を達成しました。ここでは、このプロセスをXDR-50バイオリアクターにスケールアップしました。

細胞は培養期間中、指数関数的に増殖し、9日後には179MVC/mLの細胞密度に達しました。

灌流工程の拡張性 - ReadyToProcess WAVE™25～XDR-50

この2種類のバイオリアクター間のスケーラビリティを評価するために、ReadyToProcess WAVE™ 25で過去に行った5Lおよび25Lの灌流培養と、XDR-50で開発した灌流培養のすべての成長データを照合しました（Fig 1）。

このデータセットは、3つの培養方法すべてにおいて、ほぼ完全に一致しています。WAVE™社のバイオリアクターでは細胞密度が95 MVC/mLを超えるとDO調節が困難になります。XDR-50の実験では、DO調節機能は最大容量に達しませんでした（データは示していません）。このようにロッキング槽から撹拌槽へのスケーラビリティは良好でありますが、XDR-50では酸素の移動がより効率的であるため到達可能な最大細胞密度が高くなる可能性が高いです。

Fig 1.ReadyToProcess WAVE™では5Lと25Lの作業容積（wv）で、XDR-50では47Lのwvで、強化されたN-1灌流プロセスの成長と生存率を示しています。

灌流した細胞を用いたフェッドバッチプロセスとバッチ培養した細胞を用いたフェッドバッチプロセス

179MVC/mLの灌流培養液のごく一部を採取し、これをフェッドバッチで培養したシェイクフラスコの播種に使用しました。比較のため、バッチ培養したN-1細胞を用いて2本のシェークフラスコに播種し、同じフェッドバッチプロセスで培養しました。バッチ法と灌流法で播種したフェッドバッチプロセスの成長と生産性のデータを、それぞれFig 2とFig 3に示します。灌流培養した細胞とバッチ培養した細胞の間で、成長、生存率、力価はよく一致しており、力価のわずかな差は通常のバッチ間の変動の範囲内でした。

Fig 2.灌流した細胞を播種したシェイクフラスコでのフェッドバッチ培養と、バッチ培養した細胞の成長と生存率のデータ。

Fig 2.灌流した細胞とバッチ培養した細胞を播種したシェイクフラスコでのフェッドバッチ培養のタイターデータ。

さらに、収穫したサンプルの製品品質プロファイルを分析したところ、同程度の凝集体と電荷分布、および同程度のN-グリカンプロファイルが見られました（Fig 4）。

Fig 4.灌流した細胞とバッチ培養した細胞を播種したシェイクフラスコでのフィードバッチ培養の製品品質プロファイル。(A)凝集体、(B)電荷分布、(C)N-グリカンプロファイル。

シードトレインを強化するためにN-1灌流を導入することには多くの利点があります。例えば、細胞密度の高い培養を行うことで、生産工程をより高い細胞密度でシードすることができます。播種密度を高くすることで、細胞の蓄積をより安価なシードリアクターに押し付け、生産工程を短縮することができ、生産能力を高めることができます。また、パーフュージョンにより、より小型のN-1バイオリアクターを使用することができ、床面積だけでなく経費も節約できます。もちろん、灌流プロセスでは、細胞培養液の消費量が増え、プロセスが複雑になるため、上流工程を設計する際にはどちらも考慮する必要があります。

N-1灌流の利点にもかかわらず、これは、生産ステップにおいて細胞が成長と生産の能力を維持できる場合にのみ選択肢となります。ここでは、N-1灌流が、フェッドバッチプロセスにおける成長、生産性、製品品質に影響を与えないことを示しています。これらの結果は、プロセス全体の柔軟性と生産性を高めるために、強化されたシードトレイン戦略を使用することを支持するものです。

我々は、ReadyToProcess WAVE™ 25システムの2つのスケールで灌流プロセスを開発しました。ここでは、これらのスケールで灌流された細胞の生存率およびVCDが、Xcellerex™ APSを用いて灌流モードで運転されたXDR-50撹拌槽バイオリアクターからのものと同等であることを示しています。これらの結果は、大容量への優れたスケーラビリティを示すだけでなく、ReadyToProcess WAVE™ 25がXcellerex™ APSのスケールダウンモデルとしての可能性を示しています。

参考文献

  • Brunner M, Fricke J, Kroll P, Herwig C. Bioprocess Biosys Eng. Investigation of the interactions of critical scale-up parameters (pH, pO2 and pCO2) on CHO batch performance and critical quality attributes. 2017 40(2):251-263. doi: 10.1007/s00449-016-1693-7.
  • Yang W, Lu J, Kwiatkowski C, et al. Perfusion seed cultures improve biopharmaceutical fed-batch production capacity and product quality.Biotechnol Prog. 2014 30(3):615-625. doi: 10.1002/btpr.1884.
  • Padawer I, Ling W, Bai Y, et al. Case study: An accelerated 8-day monoclonal antibody production process based on high density seeding densities. Biotechnol Prog. I2013 29(3):829-832.doi: 10.1002/btpr.1719.