ラテラルフローアッセイ開発における部材選択

Klaus Hochleitner博士が主催したウェビナー「Simplifying component selection in lateral flow assay development」のハイライトです。

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ラテラルフローアッセイ（LFA）は、スピードと使いやすさの点で他の追随を許しませんが、その開発には高度な情報に基づいた意思決定が必要です。最初のアイデアや情報の収集から設計の検証まで6〜12ヶ月、規制当局の承認までさらに1〜2年かかることもあります。適切なタイプのニトロセルロース（NC）メンブレンなどの重要なコンポーネントを早期に、かつ適切な方法で選択することが、LFAの開発を計画通りに、仕様内で、かつ予算内で進めるための鍵となります。ここでは、部品選定のポイントを詳しくご紹介します。

基礎編

LFAアッセイには2つのタイプがあります。1つ目は、非競合型（サンドイッチ法）で、2つの抗原結合部位（抗体はアナライトに結合し、お互いに干渉しないこと）を持つ高分子アナライトに使用されます。アナライトがサンプル中に存在する場合、テストラインでのシグナルの増加が見られます。サンドイッチ法の有名な例は、妊娠検査です。

2つ目のタイプは競合法として知られており、2つの結合部位を持たない低分子アナライトに使用されます。標的分子に2つ以上の抗体を結合させることはできないので、アナライト分子を含むテストラインを使用する必要があります。アナライト分子がサンプル中に存在する場合、テストラインでのシグナルは減少します。競合法の例としては、乱用薬物の検査に用いられるものがあります。

反応メンブレンの主な検討事項

正しいメンブレンを選択することは、多くの場合、設計されるテストの性質に起因します。以下の点を考慮しながら、多くのバリエーションをテストする価値があります。

キャピラリーライズタイム

これは、液体（通常は水）がメンブレン表面の決められた距離を流れるのにかかる時間として知られています（業界標準は40mm）。すべてのメーカーは、定義されたキャピラリーライズタイムに合わせてメンブレンを製造しています。液体がテストラインとコントロールラインの両方を通過する速度が、テストの感度と特異性を決定します。水や尿などの水性サンプル用のLFAは、一般的に遅いメンブレン速度（170～185秒）を使用します。唾液や再溶解した固形物など、より粘性があるサンプルには、より速いメンブレン速度（80～100秒）のテストがよく使われます。

すべてのメンブレンのキャピラリーライズタイムの仕様には、上限と下限があります。ほとんどの製品のメンブレンは、この範囲の中央に位置しますが、時折、上限と下限の近くに位置するリールを入手することがあります。例えば、特に高速のメンブレンでは、サンプルがメンブレンを素早く通過するため、偽陰性の結果になる傾向があり、低速のメンブレンでは、偽陽性のシグナルやメンブレンのクリアランスの問題が発生します。まれに、仕様限界の両側で問題が発生することがあります。これを行うためには、異なる速度定格のメンブレン（目的のキャピラリ上昇速度と重なる）を選択するか、独自のキャピラリーライズタイムの仕様を持つカスタマイズされたメンブレンを求める必要があるかもしれません。

メンブレンバッキング

ニトロセルロース（NC）メンブレンの製造では、原料を水よりも沸点の低い有機溶媒に溶かし、固体表面に流し込みます（これにより、バッキングが無いメンブレンとバッキングがあるメンブレンができます）。バッキングがないメンブレンは、エアサイドとベルトサイドに分かれています。エアサイドの構造は粗くてランダムなので、ベルトサイドに比べてばらつきが大きくなり、タンパク質の結合能力が低下します。ベルトサイドの構造は高密度で規則的なので、タンパク質の結合能力が高くなります。バッキングがあるメンブレンは、バッキングがないメンブレンと比較して機械的強度が向上しますが、使用可能な面はエアサイドの1面のみです。何を選んだらよいかわからない場合や、LFAを初めて使用する場合は、取り扱いの容易さからバッキングがあるメンブレンを選ぶのがよいでしょう。

メンブレンブロッキング

NCマトリックスは、タンパク質結合能の点で好ましいですが、テストライン上にないNCは、標的分子と結合する可能性が高く、テスト感度に重大な影響を与えます。これを避けるためには、テストラインとコントロールラインに隣接するフリーのNCを2つの方法でブロッキングすることができます。1つは、製造時にメンブレンにブロッキング試薬をコーティングする方法、もう1つは、ブロッキング試薬をサンプルパッドまたはコンジュゲートリリースパッドのいずれかに組み込み、サンプルよりも先にメンブレンに沿って移動させる方法（「ブロッキングオンザフライ」と呼ばれます）です。後者の方がコスト的にも時間的にも効率的ですが、メンブレンに塗布するブロッキング試薬の量をコントロールすることはできません。

メンブレンの界面活性剤

NCメンブレンに含まれる界面活性剤は、メンブレンの親水性を高めて流速を微調整したり、タンパク質分子を部分的に変性させて抗体を固定化したりすることで、抗体結合に影響を与えます。界面活性剤はメーカーによって使用されているものが異なり、また製造工程の各段階で使用されているものも異なるため、これらのメンブレンを使用する前に、特定の用途に合わせてテストすることが最善の方法です。ターゲットの結合に対する固定化の効果は、使用するエピトープが直線的なもの（単一の直線的なペプチド鎖にターゲットを結合させる）か、確認的なもの（複数のペプチド鎖が近接している場合にのみターゲットを結合させる）かによって異なります。また、固定化に成功しても、抗体の向きによってエピトープが利用できない可能性もあります。抗体と抗原の相互作用に影響を与える、結合部位をブロックする優先的な配向があるかどうかを検討する必要があります。次に、ターゲットに結合した後の抗体同士の距離を考慮する必要があります。距離が近すぎると立体障害が発生します。抗体の干渉をチェックするために、表面プラズモン共鳴（SPR）によるエピトープマッピングを行うことができます。

パッドについて

メンブレンの両側にあるパッドも同様に性能を左右します。例えば、コンジュゲートパッドの作製時に発生するミスは、アパーチャの問題の原因となる可能性が高いです。

要約すると、LFAを開発する際に考慮すべき重要な点がたくさんあります。これらのパラメータを正しく設定するには、各コンポーネント、サンプル、抗体に関する詳細な情報が必要です。開発者の皆様には、メーカーと密接に協力して、開発プロセスによくある落とし穴を避けるよう、常にアドバイスしています。

専門家に聞く

実用可能なテストを開発できない人の共通の理由は何ですか？

さまざまな要因があります。それは、検出試薬、パッド、メンブレンの選択、バッキングカードの選択、機器のセットアップなど、何でもあります。開発プロセスにおけるあらゆる検討事項がテストの結果に影響を与えるため、これらすべての項目をテストすることが重要です。

例えばCOVID-19テストのように、テストの開発に時間がかかるのはなぜですか？

LFAが開発と臨床試験を経て市場に出るまでには、2～3年かかることがあります。優れた安定性テストは、研究開発の段階で最低1年かかります。パンデミックの際には、誰もができるだけ早く仕事をしていますが、テストの要件を満たすためには、開発と最適化に十分な時間を割り当てる必要があります。

界面活性剤を使っているかどうかで、メンブレンをどう評価しますか？

すべてのモノクローナル抗体（mAb）が特定の界面活性剤の存在下でうまく機能するわけではなく、2％～3％のmAbはまったく機能しません。性能を最適化するためには、開発の初期段階で様々な界面活性剤の存在下で抗体試験を行うことが重要です。界面活性剤の違いは検査結果に影響を与えます（例：偽陽性、偽陰性）。

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