DIGE 道場　第7回
IPGゲルの平衡化から二次元目への添加まで

24 cmのIPGゲルの場合、細胞の培養に使う直径10 ㎝のプラスチックシャーレが保存にはちょうどよい。長いストリップをピンセットつまんでくるりと丸めながらシャーレに入れてー80℃で保存しておく。ゲル面を内側に。慣れればピンセット一本でできるようになる。

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引き続きIPGゲルはシャーレにいれたまま遮光して室温に１時間放置する。1時間は超えないようにしている。このステップは必須である。また、このときシャーレは1枚1枚個別に設置するようにする。重ねて室温においても真ん中付近のシャーレはなかなか暖まらないことがある。

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次に平衡化バッファー（A）（室温）を20 ml入れる。CyDye™ DIGE Fluor Saturation Labelling Dyeの場合は20分振とうする。CyDye™ DIGE Fluor Minimal Labelling Dyeの場合は途中で平衡化バッファー（B）に変え、20分振とうする（Aで20分、Bで20分、計2回行う）。平衡化バッファーの組成は下記の通り。12本分の量である。

【平衡化バッファー（A） 組成】

ウレア　90 g
1.5M　Tris-HCｌ　pH 8.8　17 ml
87％　Glycerol　87 ml
10％SDS　25 ml
超純水で250 mにする。ウレアによる吸熱反応を乗り越えて完全に室温にするために、朝から午後2時ぐらいまでかけて攪拌を続ける。使用直前にDTT（1.25 g）を加える。

【平衡化バッファー（B）　組成】

上記、平衡化バッファー（A）のDTT（1.25g）の代わりに、ヨードアセトアミドを4.5％となるよう加える。

まとめて作って分注することはしていない。そうしていた時期もあったのだが、溶かすのに結局時間がかかるため止めた。

使用している試薬とメーカー

試薬	メーカー	コード番号
尿素、EP-MB grade	ロシュ・ダイアグノスティックス	11-685-899-001
Glycerol, 87％	Cytiva	17132501
ゲルキャスティングバッファー 1.5 M Tris-HCl pH 8.8	バイオラッド	161-0798
Sodium Dodecylsulfate	和光純薬工業	191-07145

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平衡化の操作

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ブロッティングろ紙（ワットマン 3MM Chr、Cytiva社にて販売）の上にドライストリップを置く。ゲル面は上にする。このステップはとくに遮光していない。遮光した方がいいかもしれないが実験が大変になるので省略している。特に問題はないようである。12本ある場合は12本のIPGゲルが並ぶことになる。