DIGE 道場　第2回
こんなにすばらしい！2D-DIGE法

第2回　もくじ

1. 二次元電気泳動に対する誤解と2D-DIGE
2. 2D-DIGEの魅力
   • 2-1　再現性の大幅な向上
   • 2-2　定量性の向上（本ページ）
   • 2-3　網羅性の向上
   • 2-4　スループット性の向上
   • 2-5　操作の簡便性
3. 2D-DIGEが可能にした「レーザーマイクロダイセクションからのプロテオーム解析」　
4. 最後に

Dr. 近藤のコラム
コラム第2回　DIGEなおサイフの話 - 2D-DIGEは本当に高い？

2-2 定量性の向上

●二次元電気泳動法の再現性を左右する3つの要素

ここで言う定量性とは、定量的比較解析の性能のことである。二次元電気泳動法ではスポット濃度が濃いほど対応するタンパク質の含有量が多いと解釈する。ゲルを銀染色やクマシー染色することでスポットを描出しスキャナーで読み取って画像解析ソフトで測定するのが、古典的な二次元電気泳動法の定量的比較の方法である。

ここで問題となるのが、染色濃度の直線性（ダイナミックレンジ）である。銀染色もクマシー染色もさまざまなバリエーションがあるが、いずれにしてもダイナミックレンジはせいぜい3桁にとどまっている。血清中のタンパク質含有量のダイナミックレンジが11桁、細胞内タンパク質はそこまでではないと言われているものの、3桁ということはない。いずれにしても銀染色やクマシー染色では戦力不足である。

一方、2D-DIGE法ではタンパク質スポットの濃度は蛍光シグナルとして測定され、6桁（Typhoon™, Cytivaを用いた場合）のダイナミックレンジで観察される。蛍光色素を使わずに同等のダイナミックレンジでタンパク質発現を測定できるプロテオーム解析技術はない。ダイナミックレンジが狭いということは、ある発現量以上のタンパク質スポットの濃度は飽和してしまってすべて同じ発現量として観察されるということである。逆に、飽和しないように感度を設定すれば、ある濃度以下のタンパク質スポットは観察できない。ダイナミックレンジを広くすることで定量的比較解析ができるタンパク質スポットの数が増加する。

定量的比較解析の精度に貢献するのが上述の再現性である。異なるサンプルを2枚のゲルで泳動し、あるタンパク質スポットが2倍の濃度で一方のゲルで観察されたとする。今までだとそれは発現量が2倍増えている、と解釈するしかなかったのだが、実はその解釈は正確ではない。2倍増えているように見えるそのゲルではたまたまそのタンパク質がゲルに入りやすかった、という可能性があるからである（注4）。2D-DIGE法では内部標準をとることでこの種の誤差を補正できる。

注釈

注4：まったく逆の可能性もある。そのゲルでは本来そのタンパク質はゲルによく入らなかったのだが、その分をさっぴいてもタンパク質スポットの濃度は濃かった、ということもあり得る。質量分析やアレイを用いた解析でも同様に、内部標準をとることがされている。

次へ　2-3. 網羅性の向上

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