DIGE 道場　第3回
できるプロのタンパク質抽出術

第3回　もくじ

1. はじめに　～とってもDIGE（大事）なタンパク質抽出～
2. タンパク質可溶化液について　
3. 培養細胞からのタンパク質抽出法
4. 組織からのタンパク質抽出法
   • A. レーザーマイクロダイセクション法による試料調製
     1. 凍結切片の作製
     2. 確認のための凍結切片の染色（HE染色）
     3. 2D-DIGE法サンプル調製用の凍結切片の染色
     4. レーザーマイクロダイセクションによる切片切断
   • B. 凍結状態の試料からの試料調製　（本ページ）
5. おわりに

Dr. 近藤のコラム
コラム第3回　「生涯道場編」 ～戦うプロテオーム研究～

B.　凍結状態の試料からの試料調製

液体窒素で凍結された検体を凍ったまま粉末状にまで破砕し、細胞がばらばらになったところに一気に可溶化液を加える方法である。古典的には乳鉢を用いてこのような実験が行われてきた。検体数が少ないとき、検体がある程度大きいときは液体窒素で凍らせた乳鉢で十分対応できるし、試料の質もよい。たいていの方は乳鉢とすりこぎ（乳棒）で十分だろう。慣れるのに少し時間がかかるかもしれないが、「小麦粉状」のパウダーになるのが理想的、というイメージで手を動かしているとそのうちできるようになる。液体窒素を傍らに置いて、適宜補充しながら温度が上がらないようにするのがポイントである。

しかし、100検体を3日以内に処理したいという場合には乳鉢では対応できない。またごく微小な検体は乳鉢で擦っている間にどこかにいってしまう。

多検体を短時間で破砕するには、安井器械から販売されている「マルチビーズショッカー」がよい。この機械では液体窒素で凍らせておいた強度の高いスクリューキャップチューブに、同様に液体窒素で凍らせておいた検体とステンレスビーズを入れ、専用の機械の中で高速で振り回すことで検体を破砕する。処理するのは短時間なので温度が上がることはない。

この方法で、組織は小麦粉状にまでさらさらに破砕される。破砕された検体は、DNAやRNA抽出用に、やはり液体窒素で冷やしておいたスパーテルで粉末状のまま小分けすることもできる。この方法では高品質のタンパク質だけでなく、GeneChip解析に耐えうる品質のRNAも一度に数10検体安定して抽出できることを確認している。未確認だが、経験的にRLGS（Restriction Landmark Genomic Scanning）用のDNA抽出にも適しているのではないかと考えている。

（つづく）　B. 凍結状態の試料からの試料調製

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